高血压(hypertension)属于一种复杂的临床综合征,其典型特征为体循环动脉压升高,常伴有心、脑、肾等器官功能性或器质性损伤。根据相关统计数据,高血压的患病人数正逐年攀升,且其发病年龄呈现出日益年轻化的态势。中国18岁及以上居民高血压的患病率已高达约27.9%,患病人数可高达2.45亿人
[1]。依据高血压发病原因的不同,可分为原发性高血压(essential hypertension,EH)与继发性高血压(secondary hypertension,SH)这两大类别,其中,原发性高血压占绝大多数
[2]。作为极常见的一类慢性疾病,持续存在的高血压状况可能会引发冠心病、糖尿病、心力衰竭、肾脏疾病等多种并发症,对人类生命健康构成严重威胁
[3]。
高血压患者的临床表现存在个体差异,常见症状包括眩晕、头痛、心悸、耳鸣以及乏力等。从中医学角度分析,高血压可归类于“眩晕”“头痛”等病症范畴,其病机主要与肝阳上亢、痰饮内停、肾阴亏虚等相关,且这些病机常相互关联、共同作用而引发疾病
[4]。中医在高血压防治中强调整体观念,融合辨证论治理论,实施个性化诊疗
[5]。遵循“治未病”理念,早期干预可降低发病率与死亡率,减少并发症。近年来,中药在调控血压水平、改善患者临床症状以及降低心、脑、肾等重要靶器官损伤方面,逐步显现出其独特优势
[6]。平肝潜阳方(Pinggan Qianyang Formula,PGQYF)作为治疗原发性高血压的经典中药方剂,以“天麻钩藤饮”为底方,由石决明(
Haliotidis concha)、决明子(
Cassiae semen)、夏枯草(
Prunellae spica)、野菊花(
Chrysanthemi indici Flos)、川芎(
Chuanxiong rhizoma)、牛膝(
Achyranthis bidentatae Radix)、葛根(
Puerariae lobatae Radix)、莱菔子(
Raphani semen)配伍组成,遵循“平肝三法”的组方原则:以“平肝”为核心,辅以“疏肝、清肝、养肝”三法,通过调节脏腑气机运行,恢复机体阴阳平衡而达到平肝潜阳、缓解头痛的效果。在药物配伍方面,选用石决明与决明子共为君药,二者均味咸性寒,归肝经,既可平肝潜阳、重镇安神,又具明目清肝之效;臣药选用川芎,其性辛温,善行气开郁、活血止痛,可上行头目、中开郁结、下调经水;夏枯草与野菊花亦为臣药,二者味辛苦性寒,长于清泻肝火,为清肝之要药。以味酸甘之牛膝、味辛甘之莱菔子,共为使药,二者配伍可引诸药归肝经,引气血下行;另配伍葛根引诸药上达巅顶,与牛膝、莱菔子升降相和,此君、臣、使三类药协同配伍,在高血压及肝阳上亢型眩晕的临床治疗中取得了显著疗效。前期临床随机对照研究对比了平肝潜阳方联合常规西药与单纯常规西药的治疗效果,结果表明,经干预后,两组受试者的血压水平较基线值均获得改善,中药组诊室、早间、晚间血压有效率要略高于西药组。从整体降压特征来看,中药组血压改善起效更早、降压过程更平缓、血压波动幅度更低,且疗效具有随治疗周期延长逐步凸显的特点。平肝潜阳方中药组在中医证候改善、视觉模拟评分法(visual analogue score,VAS)眩晕评分及生活质量方面的获益,均优于单纯西药治疗
[7],但对其深层次作用机制尚需进一步探究。
因此,现通过网络药理学、分子对接与分子动力模拟技术,深入分析平肝潜阳方治疗原发性高血压的作用机制,旨在为平肝潜阳方的后续研究奠定理论基础、提供参考依据。
1 研究方法
1.1 平肝潜阳方活性成分及靶点筛选
通过中药系统药理学平台TCMSP数据库(
https://tcmsp-e.com)、HERB数据库(
http://herb.ac.cn)获取平肝潜阳方(石决明、决明子、夏枯草、野菊花、川芎、牛膝、葛根、莱菔子)的药物有效成分,筛选标准为:口服生物利用度(oral-bioavai-lability,OB)≥30%、类药性(drug-likeness,DL)≥0.18。随后借助PubChem数据库(
https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov),获取平肝潜阳方中各活性成分SMILES号并借助Swiss Target Prediction平台(
http://www.swisstargetprediction.ch)进行靶点预测。最终,对靶点信息汇总去重,并借助 UniProt 数据库(
https://www.uniprot.org)校准。
1.2 原发性高血压疾病靶点和交集靶点的获取
分别在GeneCards(
https://genecards.org)和OMIM数据库(
https://omim.org)检索“Essential Hypertension”相关靶点。对于GeneCards数据库来源的靶点,靶点的Score值反映了其与疾病的相关性,保留“Relevant Score”高于中位数的靶点,随后与从OMIM数据库获取的靶点进行汇总与去重,从而获得原发性高血压疾病靶点。最后借助微生信网站(
https://www.bioinformatics.com.cn/)绘制韦恩图,以此获得药物-疾病交集靶点。
1.3 “平肝潜阳方-活性成分-靶点”网络的构建
将平肝潜阳方中涉及的中药、活性成分及靶点信息导入Cytoscape3.10.0软件中,进行可视化处理,构建“平肝潜阳方-活性成分-靶点”网络,并进行拓扑分析。
1.4 PPI网络构建
将平肝潜阳方治疗原发性高血压(EH)的潜在靶点信息输入STRING数据库(
https://string-db.org/),以“ Homo sapiens”作为物种限定范围,隐藏游离节点,以此构建潜在作用靶点的蛋白质-蛋白质相互作用(protein-protein interaction,PPI)网络,并进一步筛选出平肝潜阳方治疗原发性高血压的核心作用靶点。之后把PPI网络的数据文件导入Cytoscape3.10.0软件,运用该软件的“Network Analyze”功能进行分析,获取网络拓扑学参数。
1.5 GO功能及KEGG通路富集分析
利用DAVID数据库(
https://david.ncifcrf.gov)对平肝潜阳方治疗原发性高血压的潜在靶点GO(gene ontology)与 KEGG(Kyoto encyclopedia of genes and genomes)富集分析。根据
P值筛选出生物过程 (biological processes,BP),细胞组分(cellular components,CC), 分子功能(molecular function, MF)排名前10的条目,以及排名前20的KEGG信号通路,筛选结果上传至微生信平台进行可视化处理,最终结果以柱状图和气泡图呈现。
1.6 核心通路和核心靶点网络图
预先准备好包含药物有效成分、对应靶点以及通路信息的“network”文件和“type”文件,将上述两个文件导入Cytoscape3.10.0软件,构建核心通路与核心靶点网络,并开展拓扑分析。
1.7 分子对接验证
通过分析PPI网络图获得排名前6的核心靶点蛋白,用UniProt数据库查询关键靶点基因PDBID,使用RCSB PDB网站(
https://www.rcsb.org/)下载核心靶点对应的蛋白质分子(受体)的3D结构,利用 AutoDockTools1.5.7软件,对下载的蛋白质分子进行去水、加氢及计算电荷等预处理操作,处理完成后将其作为分子对接的受体。通过药物-有效成分-靶点网络图筛选出度值排名前6的平肝潜阳方关键活性成分,借助 TCMSP 数据库,获取这些关键活性成分的mol2格式文件,并将其导入AutoDockTools1.5.7软件中,添加原子电荷,保存为pdbqt格式,以此作为分子对接的配体。最终,通过AutoDockVina工具实施分子对接,获得对接过程中的结合能数值,随后运用 PyMol 软件对分子对接结果进行可视化分析。
1.8 分子动力学模拟
为深入探究受体-配体复合物的相互作用强度及其稳定性,将开展分子动力学模拟。此次动态模拟采用GROMACS 2025.3软件进行,在启动模拟前,先借助 sobtop 工具生成小分子的拓扑文件,并利用Gromacs内置命令对蛋白质分子结构及其对应的拓扑文件进行预处理。为精确模拟生理环境,采用Amber14sb力场与TIP3P溶剂化模型,通过将盐浓度设定为0.15 mol/L实现体系中性。采用共轭梯度算法进行500步能量最小化[收敛容差100.0 kJ/(mol·nm),步长0.01 nm],随后依次进行100 ps(时间步长1 fs)限制性动力学模拟和100 ns(时间步长2 fs)的正式模拟。通过GROMACS内置工具提取轨迹,在100纳秒时点获取最终结构(已消除周期性边界条件)。随后评估蛋白质-小分子复合物的关键指标,包括均方根偏差(root mean square deviation,RMSD)和蛋白质回旋半径(radius of gyration,Rg)。进一步构建三维自由能地貌图(free energy landscape, FEL),以可视化复合物构象稳定性,这些地貌图以回旋半径(Rg)和均方根偏差(root mean square deviation, RMSD)为坐标,显示体系在构象空间中的自由能分布,深蓝色低洼区域指示全局自由能最小值,对应最优热力学稳定构象。
2 结果分析
2.1 平肝潜阳方活性成分及对应靶点
TCMSP数据库未检索到石决明,再使用HERB数据库检索石决明,检索到石决明6种中药活性成分,筛选标准:Lipinski五原则,去除因无法找到SMILE号和无分子量而无法预测的3种活性成分,其余3种活性成分进一步使用SwissADME平台进一步开展筛选,筛选标准设定为:胃肠道吸收活性为“high”,且在“Drug-Likeness”项中有两个及以上结果为“Yes”,按照此标准筛选后,最终确定2种活性成分。剔除Swiss Target Prediction数据库中无靶点的成分,经整理统计,共收集到平肝潜阳方的有效活性成分69个,其中石决明2个、决明子13个、夏枯草11个、野菊花11个、川芎6个、牛膝19个、葛根4个、莱菔子3个,剔除重复成分12个,最后得到药物活性成分57个,主要有川芎嗪、川芎萘呋内酯、槲皮素、山柰酚、芒柄花素、菜油甾醇、木犀草素、β-谷甾醇、豆甾醇、肉豆蔻酮和黄芩苷等。通过Swiss Target Prediction数据库(
https://swissadme.ch/)预测上述活性成分的潜在作用靶点,去除Probability值为0的靶点基因后得到4 194个,去重处理后得到722个。
2.2 原发性高血压疾病靶点和交集靶点
通过GeneCards、OMIM数据库检索,然后以Score值大于第3次中位数为临界值(relevance score≥5.703 249 931),对结果进行筛选、合并,并去除重复项,确定原发性高血压相关靶点,最终得到1 454个与高血压疾病紧密相关的靶点。借助微生信网站来绘制韦恩图,把平肝潜阳方里中药活性成分靶点基因,以及原发性高血压的靶点基因导入,经过分析绘制,最终得到 247 个交集靶点,如
图1所示。
2.3 “平肝潜方-活性成分-靶点”网络的构建
将潜在作用靶点及其对应的活性成分、中药,一同导入Cytoscape3.10.0软件,构建“平肝潜阳方-活性成分-靶点”网络(
图2),该网络由312个节点(涵盖8种中药、57个有效成分以及247个潜在作用靶点)和1 861条边组成,节点间的连线能够清晰且直观地展示中药、活性成分与靶点之间的相互作用关系。
2.4 PPI网络构建
将平肝潜阳方治疗原发性高血压所涉及的 247 个潜在作用靶点导入STRING数据库,开展PPI网络的构建与分析工作。完成分析后,下载TSV(tab-separated value)文件并将其导入Cytoscape3.10.0软件,进行PPI可视化操作,同时去除游离节点,最终获得一个247个节点,4 651条边的PPI网络(
图3)。根据degree值筛选出前20位核心靶点,推测平肝潜阳方中丝/苏氨酸蛋白激酶1(serine/threonine-protein kinase 1,AKT1)、肿瘤坏死因子( tumor necrosis factor,TNF)、肿瘤蛋白p53(tumor protein 53,TP53)、B淋巴细胞瘤2(B-cell lymphoma 2,BCL2)、表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)、原癌基因酪氨酸蛋白激酶Src(proto-oncogene tyrosine-protein kinase Src,SRC)、信号转导与转录激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)、半胱天冬酶3(caspase 3,CASP3)、雌激素受体1(estrogen receptor 1,ESR1)、Jun原癌基因(Jun proto-oncogene,JUN)、过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferative activated receptor gamma,PPARG)、热休克蛋白90-α家族A类成员1(heat shock protein 90-alpha family class A member 1,HSP90AA1)、丝裂原活化蛋白激酶3(mitogen-activated protein kinase 3,MAPK3)等为治疗EH的关键靶点(
图4)。
2.5 GO及KEGG富集分析
将247个潜在靶点基因输入DAVID数据库,物种设定为“Homo sapiens”,分别进行GO富集分析,基于 GO 富集分析结果,以
P<0.01为筛选条件,选取排名前10的信息。之后,利用微生信网站绘制GO 分析条目中生物过程(biological process,BP)、细胞组分(cellular component,CC)、分子功能(molecular function,MF)三合一柱状图(
图5);该柱状图的纵轴表示潜在靶点基因的参与数量,从
图5可以清晰看出,潜在靶点基因在生物过程(BP)方面的参与度较高,主要涉及肽基酪氨酸磷酸化、激酶活性的正向调节、蛋白质磷酸化、MAPK 级联的正向调控以及磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶 B 信号转导的正向调节等过程。在 KEGG 富集分析中,共获得 178 条相关条目,选取排名前 20 的条目,这些条目主要集中在磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(PI3K-AKT)信号通路、丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路、糖基化终末产物-糖基化终末产物受体( AGE-RAGE) 信号通路、表皮生长因子受体(EGFR) 信号通路以及癌症通路等途径,如
图6和
图7所示。
2.6 核心通路和核心靶点网络图
导入Cytoscape3.10.0软件,构建核心通路和核心靶点网络,该网络由334个节点(8个中药、57个有效成分、247个潜在作用靶点)、1 908条边构成(
图8)。
2.7 分子对接结果
将平肝潜阳方用于治疗原发性高血压的6种关键活性成分,即槲皮素、山柰酚、木犀草素、β-谷甾醇、豆甾醇和黄芩苷分别与核心靶点AKT1、TNF、TP53、BCL2、EGFR、SRC开展分子对接,对接结果如
表1所示。通常,结合能绝对值越大,配体与受体结合越稳定,结合能小于-5.0 kJ/mol时代表有较好的结合活性;结合能小于-7.0 kJ/mol 时说明存在强烈的结合活性。研究结果表明,上述6种核心成分与6个核心靶点结合能均小于-5.0 kJ/mol,呈现良好的结合活性。TNF、BCL2、EGFR与槲皮素、山柰酚、木犀草素、β-谷甾醇、豆甾醇和黄芩苷以及AKT1与β-谷甾醇、豆甾醇,SRC与槲皮素、木犀草素、豆甾醇和黄芩苷均具有强烈的结合活性(
图9)。根据分子对接所得数据,可以明确所有小分子均能够成功进入靶蛋白的活性中心。为更直观地呈现对接效果,从中挑选出与每个靶蛋白对接效果最优的小分子作图进行展示。其中木犀草素与TNF、豆甾醇与 EGFR、黄芩苷与TNF在各自相互作用中展现出显著亲和力(
图10)。
2.8 分子动力学模拟
均方根偏差(RMSD)是评估蛋白质与配体构象稳定性的重要且有效指标,RMSD的偏差值越小,构象的稳定性越佳。从
图11可见,RMSD在早期有一定的波动,然而,TNF-木犀草素与EGFR-豆甾醇在70 nm后趋于稳定,TNF-黄芩苷则在65 nm后稳定。这表明小分子配体与蛋白质结合后,蛋白质构象不会发生显著变化,二者的结合状态相对稳定。
回转半径(Rg)是用于衡量蛋白质整体结构紧密程度的一个指标。从
图12可见,TNF-木犀草素、EGFR-豆甾醇和TNF-黄芩苷具有稳定的回旋半径。该结果与均方根偏差(RMSD)结果一致,表明蛋白质构象稳定且折叠紧凑。
三维(3D)自由能地貌图系统分析了体系在构象空间中的能量分布特征。
图13以回旋半径(Rg)和均方根偏差(RMSD)为反应坐标,定量表征构象演变的自由能变化。分析显示,TNF-木犀草素复合物在特定Rg(1.42~1.45 nm)与RMSD(0.17~0.22 nm)范围内存在全局自由能最小值区域(图中深蓝色洼池),表明该构象状态下体系达到热力学最优稳定性,如
图13(a)所示。EGFR-豆甾醇复合物中,当Rg(1.585~1.61 nm)与RMSD(0.18~0.26 nm)范围时自由能达到最低值,如
图13(b)所示。类似地,TNF-黄芩苷复合物在Rg(1.40~1.42 nm)与RMSD(0.20~0.33 nm)范围内展现出显著稳定的构象,如
图13(c)所示。
3 讨论
借助网络药理学展开分析,结果显示平肝潜阳方中包含57种具有降压活性的化合物。其中槲皮素、山柰酚、木犀草素、β-谷甾醇、豆甾醇、黄芩苷、芒柄花素、汉黄芩素、菠菜甾醇、小檗碱、蒙花苷和川芎嗪等为关键活性成分。这些活性成分涉及247个与原发性高血压相关的潜在作用靶点,其中AKT1、TNF、TP53、BCL2、EGFR、SRC、STAT3、CASP3、ESR1、JUN、PPARG等20个为核心靶点。此外,还关联到PI3K-Akt信号通路、MAPK信号通路、AGE-RAGE信号通路、EGFR信号通路等10条主要信号通路。由此可见,平肝潜阳方治疗原发性高血压的作用机制呈现出复杂多样的特点,具备多成分、多靶点、多通路的特性。
现代研究证实,槲皮素及其代谢产物能够抑制血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell,VSMC)中烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate hydrogen,NADPH)氧化酶的活性,进而产生显著的抗氧化作用
[8]。这一机制有助于减少血管内的超氧化物生成,并改善血管内皮功能,进而实现血压的降低。槲皮素还可以通过增加一氧化氮(nitric oxide,NO)的生物利用度,调节血管活性因子和保持血管稳态来发挥抗高血压作用
[9]。山柰酚、槲皮素和木犀草素均属于黄酮类化合物,现代研究表明,它们可通过多种机制发挥降压作用,具体包括调控内皮素(ET)的合成、调节肾素-血管紧张素-醛固酮系统、平衡一氧化氮(NO)水平、干预钙离子通道活动,以及抑制血管平滑肌细胞的增殖等
[10]。有研究显示,木犀草素可通过抑制下丘脑室旁核内由NF-κB介导的炎症反应以及PI3K/Akt信号通路,发挥减轻高血压的作用。此外,木犀草素还能显著降低室旁核中活性氧(reactive oxygen species, ROS)的生成量,进而降低机体内的氧化应激水平,最终对中枢神经系统起到保护作用
[11]。β-谷甾醇与豆甾醇均归类为植物甾醇,二者具备相似的生物活性,包括抗炎、抗氧化、调节血脂、抗动脉粥样硬化形成以及抑制血管重构等作用
[12]。体内实验表明,β-谷甾醇能够抑制斑块形成和血小板激活,并降低血清总胆固醇(total cholesterol, TC)和甘油三酯(triglyceride,TG)水平。体外实验则显示,β-谷甾醇能抑制血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)的脂质沉积和表型转化,从而减轻血管阻力,有助于血压的控制
[13]。研究表明β-谷甾醇在体外和体内均以剂量依赖性的方式抑制肺动脉平滑肌细胞(pulmonary artery smooth muscle cells,PASMCs)的增殖、 促进凋亡并抑制表型转换来缓解肺动脉高压
[14]。黄芩苷展现出显著的抗氧化活性,其作用机制涵盖多方面:能够抑制细胞凋亡、调控抗氧化酶、激活抗氧化能力,可与金属离子形成配合物,还能有效清除活性氧和活性氮等物质,进而发挥强大的抗氧化功效
[15]。
AKT1、TNF、TP53、EGFR、SRC、BCL2作为排名靠前的6个核心靶点,其中AKT1作为磷脂酰肌醇-3激酶与蛋白激酶B(PI3K/AKT)信号通路中极为关键的下游靶点,主要参与并调控炎症反应。当PI3K/AKT信号通路被激活时,这一过程会促使肺血管壁发生增厚现象,诱导肺动脉平滑肌细胞进行增殖及凋亡
[16]。肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)在机体内主要发挥介导免疫应答与炎症反应的作用,同时能够调控心肌细胞的凋亡与坏死进程,并对血管内皮细胞的损伤产生调节效应。当TNF在体内异常表达时,会触发广泛的炎症反应,这种炎症反应不仅会加剧血管内皮细胞的损伤,还会促使平滑肌细胞增生,导致血管外周阻力增加。因此,TNF-α的异常表达被视为高血压脑出血发病的一个关键因素
[17]。
TP53基因的表达与细胞凋亡的增多紧密相关,相关研究显示,当心肌细胞中
TP53基因表达水平上调时,会致使细胞活性降低
[18]。SRC属于酪氨酸蛋白激酶,它能够激活烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase,NOX),促使该酶产生活性氧(reactive oxygen species,ROS),并引发氧化应激反应,最终推动高血压等心血管疾病的发生发展
[19]。此外,它还可通过损害血管内皮的功能,参与血管重构并调控血压
[20]。EGFR可诱导促炎介质的生成,改变基质构成,同时推动血管平滑肌细胞增殖与迁移,并引发血管重构,这些作用机制共同加速了高血压等疾病的进展
[21]。BCL2是一种关键的抗凋亡蛋白,可以作为现代心脏保护疗法的靶点
[22]。
KEGG通路富集分析揭示,平肝潜阳方可能借助一系列信号通路减少炎症因子表达、抗氧化应激,来实现其降压效果,这些信号通路包含 PI3K-Akt信号通路、MAPK信号通路、AGE-RAGE信号通路以及EGFR信号通路等。其中,PI3K/AKT信号通路在调控细胞活性、能量代谢以及血管内皮发育方面发挥着关键作用
[23]。MAPK信号通路的激活是通过ERK、JNK和p38MAPK磷酸化及其相应的激酶介导的,p38MAPK激活NF-κB诱导炎症反应,c-JNK能够激活p53进而促使细胞内活性氧(ROS)发生积累,最终引发氧化应激反应
[24][25]。在AGE-RAGE信号通路中,AGE通过多种机制诱导高血压,如交联胶原蛋白、降低一氧化氮、增加内皮素-1的表达。当AGE与RAGE发生相互作用时,会触发活性氧的生成,同时使交感神经活性增强,这些变化最终会引发高血压
[26]。
基于上述研究成果,后续研究拟推进更为系统的体内外实验及临床验证工作,系统开展多层次湿实验验证工作,从细胞、组织及整体动物水平明确平肝潜阳方治疗原发性高血压的物质基础与作用机制,为其临床规范化应用提供坚实的实验依据。
4 结论
运用网络药理学方法,对平肝潜阳方治疗原发性高血压的有效成分、靶点基因以及信号通路展开初步探究,并通过分子对接与分子动力学模拟进行验证。研究结果表明,平肝潜阳方通过槲皮素、山柰酚、木犀草素、β-谷甾醇、豆甾醇、黄芩苷、芒柄花素等活性成分,作用于AKT1、TNF、TP53、EGFR、SRC、BCL2等靶点,调节PI3K-Akt信号通路、MAPK信号通路、AGE-RAGE信号通路等,进而舒张血管、调节炎症因子、抗氧化应激、改善血管内皮功能,从而有效改善高血压及其伴随症状。后续将在现有研究的基础上,进一步开展深度机制体内外实验及临床验证工作,以期为平肝潜阳方治疗原发性高血压的临床规范化应用提供更为充分的科学依据。
PDF
(31966KB)
