绝经后骨质疏松症(postmenopausal osteoporosis,PMOP)是指女性绝经后卵巢激素调节功能失衡出现雌激素水平下降,导致破骨细胞活性明显提高,体内骨吸收亢进所致的一种疾病
[1]。临床上现已经有多种成熟药物治疗PMOP,如双膦酸盐类、地舒单抗、特立帕肽等,但这些药物的治疗目标主要集中在提升骨密度、降低骨折发生率的方面
[2],临床上绝经后骨质疏松女性出现的烦躁、失眠、心悸等更年期自觉症状并未得到改善。同时,这些药物在长期应用的安全性也存在许多争议,如停药之后的反弹、潜在非典型骨折、心血管意外的风险
[3-4]等。寻找长期且安全的PMOP防治方法,是中外临床工作者亟待解决的问题。
中医药作为一种绿色安全的疗法,在PMOP治疗中疗效显著。现代中医临床多将其纳入“骨痿”“骨枯”等范畴,宗《内经》“肾气热,骨枯髓减”之论,侧重于从肾阴亏虚、虚火灼髓治疗
[5]。然而,这一观点并未体现女性的特殊生理病理规律,女子“以肝为先天,以血为用”,至绝经前后,冲任脉衰,天癸竭。冲任隶于肝肾,PMOP的病机转变往往始于肝血亏虚、冲任失调,进而因“精血同源”累及肾精匮乏;肝气疏泄失常则气机郁结,或乘土碍运,或化火伤阴,导致加剧骨骼失养。因此,PMOP的病位在肾,但其病变之枢机实则在肝,是肝血虚、肾精亏及冲任失调等多因素交织的复杂结果。雌激素撤退所致的骨吸收亢进,也恰与“肝体不足”难以制约而致的“肝用太过”这一病机高度契合。从临床实际出发,PMOP的治疗应着眼于调和肝之体用关系,中药白芍因其“养血柔肝以补体、敛阴平亢以制用”的双重功效
[6],恰好精准对应了这一病机,为从肝论治PMOP提供了经典药例。
基于此,现整理国家知识产权局专利数据中关于白芍治疗PMOP的方剂,运用数据挖掘及网络药理学技术,进一步分析其用药配伍规律及潜在分子机制
[7-8]。通过上述分析,期望形成一套从“病机指导-经典药例-配伍规律-分子机制”的多层次研究模式,为白芍的临床应用及后续实验验证提供数据支撑与理论依据。
1 资料与方法
1.1 数据挖掘
1.1.1 资料来源
国家知识产权局(
http://epub.cnipa.gov.cn)官网已发布专利数据,选择“高级检索”功能,设定关键词为“骨质疏松 and 白芍”“骨质疏松 and 芍药”“骨痿and 白芍”“骨痿and 芍药”“骨枯and 白芍”“骨枯and 芍药”,依照纳入标准、排除标准进一步筛选,整合符合标准的所有方剂。
1.1.2 纳入标准
包含白芍的方剂,且药物组成明确,用法为内服,专利详情页说明可适用于骨质疏松患者。
1.1.3 排除标准
①药物组成记载缺失及外用之膏药、散剂等;②含有钙剂及阿仑膦酸等阳性药物的中药复方;③专利详情页中明确提及只适用于老年性骨质疏松患者;④仅提取中药单体的制剂。
1.1.4 数据采集及规范化
规范化整理录入的中药名称,避免造成中药频次分析与药物关联度分析的误差。炮制工艺不同的中药如姜制半夏、法半夏等规范为半夏,甘草、炙甘草及生地、熟地黄等药性相差较大的则不去除炮制工艺,按“甘草”“炙甘草”“地黄”“熟地黄”等录入;品种不同的中药,统一按牛膝录入;去除药物产地,如川牛膝、怀牛膝等规范为牛膝;最后依据2020年版《中国药典》
[9],规范中药名为“白菖→菖蒲”“ 破骨风→络石藤”“红藤→大血藤”等。
1.1.5 数据提取与处理
依照上述纳入与排除标准,将相关中药处方录入办公软件Excel 2023软件,由第三者进行上述规范审核,建立国家专利白芍治疗PMOP相关方药数据库,包括专利名称、申请号、药物、摘要等。运用 R Studio 4.2.2软件,对方药进行频次分析及关联规则分析。
1.2 网络药理学
1.2.1 白芍成分及靶点筛选
在TCMSP数据库
[10]检索白芍的化学成分,选择口服生物利用度(oral bioavailability, OB)≥ 30%且类药性(drug-like properties, DL)≥ 0.18的有效成分,并获取有效成分的化学结构式以mol2格式储存。将所获取药物成分结构输入PharmMapper数据库
[11]获取化合物潜在治疗靶点,选择NF(norma-lized fit score)≥ 0.9的靶点蛋白。从UniProt数据库
[12]中获取靶点蛋白的基因名并去除重复值,最终确定了与活性成分有关的关键作用靶点。
1.2.2 PMOP相关靶点筛选
以“Postmenopausal Osteoporosis”为关键词,在GeneCards
[13]、OMIM
[14]数据库中进行检索,获取与疾病相关的潜在靶点。将GeneCards数据库得到的原始数据集根据Relevance score进行筛选后,与OMIM数据库筛选出的结果进行去重,最终建立疾病靶点数据集。
1.2.3 白芍-PMOP靶点PPI网络构建
将药物有效成分潜在靶点与PMOP相关靶点导入Bioinformatics and Evolutionary Genomics在线软件作图工具平台进行映射,获得“药物-疾病”共同靶点,并绘制韦恩图。采用STRING12.0数据库
[15]进行“药物-疾病”共同靶点之间作用关系的分析,设定种群为“Homo sapiens”,最小互相作用阈值为“medium confidence(0.400)”,同时隐藏网络中的无关联节点并对蛋白质互作网络进行结构精简,得到蛋白质互作网络架构(protein-protein interaction,PPI)。随后采用Cytoscape平台对PPI网络进行Analyze Network处理。
1.2.4 白芍-PMOP交集靶点GO生物功能和KEGG通路富集分析
在Metascape平台
[16]中导入“药物-疾病”的共同靶点,进行生物信息富集分析,包括京都基因与基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes, KEGG)通路以及GO分析的分子功能(molecular function, MF)、细胞成分(cellular component, CC)和生物过程(biological process, BP)富集分析,设置
P<0.01,在微生物信息学分析平台
[17]中导入数据,进行多维可视化处理,并将排行前20的条目绘制GO生物功能及KEGG通路富集分析图。
1.2.5 “白芍成分-靶点-信号通路”网络图的构建
将白芍有效成分与PMOP交集靶点与KEGG通路的互作数据,将药物有效成分与交集靶点合并,基于Cytoscape3.10.3软件构建“药物成分-靶点-信号通路”互作网络图,再运用其网络分析仪(network analyzer)功能系统,对各成分、靶点进行关键拓扑学指标分析。
1.2.6 分子对接
通过CB-Dock2分子对接平台
[18]探究13种化合物与核心靶点(PPI网络图中度值排名前3)的相互作用机制。首先,利用ChemDraw20.0软件实现了化合物分子结构的二维构建;再从RCSB蛋白质数据库下载蛋白晶体结构,去除水分子后完成蛋白前处理;最终运用CB-Dock2的深度对接算法实现配体-受体结合模式的预测。
2 结果分析
2.1 数据挖掘
2.1.1 中药频次分析
共收集相关处方107首,不包含白芍在内涉及275味中药,药物使用频次1 516,排序后取频次使用最高前18味(≥25)作为高频中药,高频中药在处方中的使用频次及占总中药处方比例如
表1所示。
2.1.2 中药性味归经
275味中药药性总频数为200次,以温(77)、寒(56)、平(55)为主;药味总频数为318次,以甘(94)、苦(93)、辛(81)多见;中药归经总频数为497次,以归肝经、肾经、肺经居多,如
图1所示。
2.1.3 关联规则分析
对录入的107首处方进行关联规则分析,使用Rstudio软件中Apriori函数计算,设置最低置信度0.8,最小规则支持度为0.1,以支持度排名,分析高频配伍规律,如
表2所示。利用R studio进行可视化分析,绘制平行坐标图,如
图2所示,可得出178项频繁项集,其中支持度大小与折线的粗细正相关,折线越粗,支持度越大;提升度大小与颜色深浅正相关,颜色越深,提升度越大。
2.1.4 中药共现规律
使用Rstudio软件中choose函数,循环计算两个中药组合的共现次数,导出共现次数≥15的中药组合,共61对组合,其中≥25的22对,如
表3所示:其中白芍-当归共现次数最高,为69次,与关联规则分析结果一致,其次依次为白芍-熟地黄,白芍-黄芪,白芍-牛膝,白芍-甘草等。
2.1.5 中药聚类分析
基于共现次数对其进行可视化分析,构建中药关联网络,转化为PAJEK文件后导入VOSvie-wer1.6.20软件,设置最小聚类数(Min.cluster size)为4,聚类级别(Resolution)为2,得到中药聚类规律图,其中每种颜色代表一类聚类,中药的节点大小随着出现次数的增多而增大。其中共聚类分析得出6个新方,如
图3所示。
2.2 网络药理学
2.2.1 白芍中的有效成分及其相关靶点
经TCMSP数据库检索并筛选,从中药白芍中获得了13种有效成分,结果如
表4所示。共获得333个相关靶标。经UniProt数据库规范基因名称后共获得107个白芍药物成分的潜在靶点。
2.2.2 PMOP的疾病靶点
在Genecards数据库中获取1 501个与疾病有关的潜在靶点,计算Relevance score的中位数为2.791 71,并根据此进行数据筛选,得到716个疾病靶点,与OMIM数据库筛选的45个疾病靶点进行去重,最终确定了749个疾病靶点。
2.2.3 “白芍-PMOP”共同靶点及PPI网络
将107个药物靶点与749个疾病靶点上传至Bioinformatics and Evolutionary Genomics在线平台绘制出Venn图,最终确定了37个“药物-疾病”共同靶点(
图4)。将收集到的共同靶点导入STRING12.0数据库,构建了一个包含37个节点和184条边的PPI网络(
图5)。利用Cytoscape平台进行分析后,得到了“药物-疾病”共同靶点网络节点的相关参数,如
表5所示。
2.2.4 GO生物功能和KEGG通路富集分析
通过Metascape平台,对白芍的有效成分治疗绝经后骨质疏松症相关靶点进行GO功能富集和KEGG通路富集分析,获得466条GO生物功能条目,其中生物过程385条,主要涉及细胞对激素刺激的反应、类固醇代谢过程、腺体发育、脂质转运的调节、MAPK级联的调节等;细胞组分25条,主要涉及受体复合物、膜筏、囊泡管腔、血液微粒、细胞外基质等:分子功能56条,主要涵盖类固醇结合、核受体活性、单羧酸结合、氧化还原酶活性、激酶调节剂活性等。KEGG通路富集分析共获得93个信号通路,主要包括癌症途径、肝癌、脂质和动脉粥样硬化等。结果如
图6所示。
2.2.5 “白芍成分-靶点-信号通路”网络图的构建
导入Cytoscape软件中,构建“白芍成分-靶点-信号通路”网络图,网络图中由143个节点,498条相互关系组成(
图7)。利用Analyze Network对网络中的各个部分进行了关键拓扑学指标的分析。Degree值反映节点在交互网络中的连接密集程度,其数值与靶标蛋白参与的生物学过程呈正相关。网络拓扑学分析结果显示,前3位的靶点蛋白依次为MAPK1、EGFR、AKT1,Degree值为22、19、17,介度为0.061 9、0.036 3、0.021 1,接近中心性为0.505 3、0.474 9、0.445 1。
2.2.6 分子对接结果
将13种白芍有效成分与3个核心靶点ALB(PDB ID: 8RCP)、AKT1(PDB ID: 4GV1)、ESR1(PDB ID: 7KBS)进行分子对接,得到39组受体-配体对接结果。其中自由结合能≤-8.0 kcal/mol(1 kcal/mol=4.184 kJ/mol)的组合共有35组,其中ALB-Compound 4组合分值为-17.3 kcal/mol,得分最高,ESR1-Compound 3组合分值为-7.2 kcal/mol,得分最低。这表明白芍相关有效成分与核心靶点结合活性较好,具体分子对接结果如
图8所示,部分化合物对接模式如
图9所示。
3 讨论
PMOP的发生总的以“肾虚为本”,但结合女性绝经后生理特点来看,“肝体不足,肝用太过” 是驱动其发生、加剧病情演变的关键环节。女子“七七,任脉虚,太冲脉衰少,天癸竭”,肝肾精血同源化生,肾精虚损与肝阴不足交错存在
[19]。肝阴作为制约肝阳的物质基础,一旦亏虚,则不能濡养筋脉与潜敛肝阳,导致肝用过亢,表现为肝阳上亢、肝风内动及肝气疏泄失常的复杂状态。
在骨骼系统中,肝主筋,为“罢极之本”,肝阴充足则筋柔骨健;若肝阴不足,筋失所养,则骨骼的联结与约束能力下降,关节僵硬或动摇,此即“筋骨失和”。更为关键的是,肝用过亢之“虚阳”和“郁火”会形成一种内在的“耗损性”压力:一方面,阴虚内热可煎灼津血,炼液为痰,灼血成瘀,瘀血痹阻骨络,阻碍气血对骨骼的濡养,新骨不生
[20];另一方面,肝失疏泄,气机不畅,可导致全身气、血、津液布散失常,进一步影响脾胃运化之精微及肾所藏之精微向骨骼的输布,即“气结则骨枯”
[21]。现代研究亦为此提供了佐证:肝失疏泄所致的情志应激状态,可通过激活“下丘脑-垂体-肾上腺”轴,释放过量皮质醇,进而抑制成骨细胞活性
[22];同时,“肝用过亢”的微观表现与交感神经系统过度兴奋相关,可能通过β
2肾上腺素能受体信号通路,促进破骨细胞分化并加速骨吸收
[23]。因此,“肝体不足,肝用太过”加速了PMOP的演变,是连接“肾虚”与“骨痿”的重要桥梁,也是绝经后女性常伴烦躁易怒、潮热盗汗等不适症状,且骨量流失速度远高于男性的重要理论依据。
白芍是妇科常见用药,在调和肝之“体用”方面有独特的作用。一方面,白芍味酸,主入肝经,能敛阴养血、滋补肝体,直接补充绝经后因肾精亏虚所耗损的肝阴肝血,从而濡养筋脉与骨骼;另一方面,其性微寒,能平抑过亢之肝阳、柔肝缓急以调肝用,有效制约因肝体失养导致的虚性亢奋状态,缓解由此引发的骨痛与筋挛,为骨修复创造稳定的内在环境。
3.1 用药规律
从数据挖掘发现,处方中配伍白芍用药以温、寒、平为主;药味上以甘、苦、辛多见。这也反映了治疗PMOP主要在气血不足之温养及疏泄过亢之寒降两方面,“酸甘化阴”“酸苦涌泻为阴”,是以滋养肝肾之阴,调补冲任;辛则散行之功,可散肝上亢之气。用药以归肝经、肾经、肺经居多,肝肾自不必多言,人体之气以左升右降,肝气左升失常,肺之肃降亦受影响,以肺经之药自有精义。如处方中高频中药黄芪,《长沙药解》言“入肺胃而益卫气,佐以辛温则能发,辅以酸凉则善敛”
[24],黄芪既有益气而助生血之功,又可助白芍调和营卫,恢复气机正常运动。药物配伍方面,白芍配伍当归,是以养血补血,又和血敛肝,重在调补女子冲任之虚;配伍熟地、牛膝、杜仲等,是精血同补、肝肾同源,一气同求的药理;又有佐甘草、茯苓一类,酸甘可缓急止痛,又扶助脾土、健运中焦,共奏扶土泻木之用
[3],是“见肝之病,知肝传脾”的古训体现。核心处方中白芍、白术、补骨脂、狗脊、女贞子也是全面概括,重视肝肾同补,生发精血,也扶助中焦,平肝之逆。
3.2 分子机制
从网络药理学分析来看,白芍中有效成分治疗PMOP的核心靶点为ALB、AKT1、ESR1、PPARG、EGFR。ALB是评估人体营养状况的重要指标,李金娟等学者发现,PMOP患者中血清ALB水平显著低于正常绝经女性,且与β-CTX、TRAP-5b骨代谢指标均呈负相关。这表明当血清中的白蛋白水平较低时,骨的吸收和破坏活动可能更为活跃
[25]。AKT1是PI3K/AKT信号通路的核心分子,破骨细胞内的AKT通路被激活后可导致其过度分化和活化,加剧骨吸收进程
[26]。ESR1在绝经后骨质疏松的发病机制中扮演着核心角色,其功能减退是导致骨代谢失衡的关键因素
[27-28]。女性绝经后伴随发生的雌激素水平下降,直接导致由ESR1介导的雌激素信号通路作用减弱,这不仅影响了成骨细胞的活性与骨形成能力,也加剧了破骨细胞主导的骨吸收,从而引发骨质流失。PPARG是决定骨髓间充质干细胞向脂肪细胞分化的关键转录因子
[29]。在绝经后雌激素缺乏的状态下,PPARG的活性或表达水平相对增强,这会促使骨髓基质细胞更多地分化为脂肪细胞,而不是成骨细胞,从而导致骨形成减少和骨髓脂肪堆积
[30]。EGFR的激活能够介导下游的PI3K/Akt信号通路,与成骨细胞分化和骨形成的促进密切相关。有研究发现,EGFR的激活通过磷酸化其下游的PI3K和Akt蛋白,可以促进H型血管生成和成骨相关因子(如OSX、RUNX2)的表达,有效增加骨小梁数量并改善骨微结构
[31]。
富集分析显示,白芍治疗PMOP可能通过多种生物过程及多通路调控。研究热点的主要相关通路为雌激素受体通路、FoxO信号通路、MAPK信号通路,与多种癌症通路相关,这主要可能是基因变异干扰或骨转移引起的。其中,FoxO家族与骨代谢平衡有密切关系:FoxO1精确调控骨髓间充质干细胞向成骨细胞的分化过程,并与Wnt/β-catenin通路相互作用共同促进骨形成
[32];FoxO3通过抑制NF-κB/MAPK等炎症信号通路,间接遏制破骨细胞的过度活化
[33];此外,FoxO3还能激活细胞自噬过程,通过上调LC3、Beclin-1等自噬相关基因的表达,维护骨骼细胞的内部稳定
[34-35]。值得注意的是,该通路的活性受到PI3K/AKT磷酸化和SIRT1去乙酰化等翻译后修饰的精密调控
[36]。MAPK信号通路主要通过促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化、抑制破骨细胞的分化
[35-36]。分子对接结果表明,白芍中核心靶点与药物成分结合活性较好。
4 结论
通过数据挖掘及网络药理学的方法,围绕“肝体不足,肝用太过”的主要病机,为白芍在PMOP的应用提供了理论依据。白芍的主要配伍有当归、熟地、黄芪等,主要核心处方用药为白芍、白术、补骨脂、狗脊、女贞子,肝肾同源、扶土抑木等经典理论的体现。白芍可能通过AKT1、ESR1、PPARG、EGFR等靶点介导雌激素受体通路、MAPK通路、FoxO通路等改善成骨诱导与破骨分化的平衡。然而,由于专利数据中用药剂量单位的不统一,未对药物用量进行细化研究,同时未进行体内外实验的验证,值得进一步研究。
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