慢性肾脏病(chronic kidney disease,CKD)已成为全球重要的公共卫生问题,其发病率和患病率持续上升,据统计,CKD的患病人数在2021年已达6.7亿人,其中中国占比超10%,给社会医疗、经济带来巨大的负担
[1]。CKD的病因多样,但其临床表现和病理进展具有一定的共性,如肾小球硬化、肾小管萎缩和间质纤维化,伴随炎症和血管稀疏等病理特征
[2]。这些病理变化在几十年来已有描述,但其分子驱动机制尚不明确。近年来研究表明,microRNA等非编码RNA的异常表达可通过多种机制介导CKD及其并发症的病理进程,被确定为CKD相关病理因子
[3]。然而,单纯依赖单一类别的分子标识物仍难以全面反映CKD复杂的病理网络,借助多组学技术,有望揭示CKD的细胞程序及其保护和破坏路径,为疾病机制的解析提供新思路。
目前,CKD的诊断主要依赖估算肾小球滤过率(estimated glomerular filtration rate,eGFR)、尿蛋白水平以及肾活检。肾活检作为诊断金标准虽能提供明确的病理学证据,但其侵入性和潜在风险限制了广泛应用
[4-5]。此外,传统生化指标如血肌酐和尿蛋白对肾脏纤维化等病理改变的敏感性有限,难以实现早期精准诊断和动态监测
[6-7]。有研究发现N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(N-acetyl-β-D-glucosaminidase, NAG)、血同型半胱氨酸等生物标志物在CKD早期诊断中显示出良好潜力,但在病因鉴别和动态监测方面仍存在局限
[8-9]。因此,急需开发非侵入性、灵敏且特异的生物标志物,以实现CKD早期诊断、病因鉴别及疗效评估。
多肽组学(peptidomics)研究生物体内所有内源性多肽的组成、结构、功能及调控机制,通常聚焦于分子量小于15 kDa的肽段,专注于在特定时间、特定生理或病理状态下,细胞、组织、体液中所有内源性多肽的全面定性、定量和功能分析
[10-12]。其中尿液多肽组学,因其非侵入性、易获取和富含肾脏病理信息的独特优势,成为CKD研究的新兴工具
[13]。尿液多肽组学通过高通量质谱技术,能够捕获尿液中成千上万个多肽的表达谱,反映肾脏的病理状态和功能变化
[14-15]。研究发现,CKD患者尿液中胶原蛋白片段、炎症相关蛋白及代谢酶片段等多肽的表达模式发生显著变化,这些变化与肾脏纤维化程度、炎症反应及代谢紊乱密切相关
[16-17],亦有研究表明胶原蛋白降解片段的减少提示肾脏纤维化进展,成为早期肾损伤的重要标志
[18]。
结合人工智能算法,对尿液多肽数据进行模式识别和特征提取,使得疾病的早期诊断、病因鉴别、分期评估及治疗反应预测成为可能
[19]。研究发现基于尿液多肽的分类器CKD273已被验证可预测CKD进展,并且在多中心队列中表现出良好的预后能力
[20]。此外,尿液多肽组学能够区分不同病因的肾脏疾病,如IgA肾病、膜性肾病、糖尿病肾病等,有助于实现精准诊断
[21-25]。因此,现系统梳理尿液多肽组学在CKD病因鉴别及病理机制中的核心进展,重点关注其与人工智能模型的联合应用成效与转化挑战,为该技术的最终临床应用提供理论基础。
1 多肽组学技术及其在CKD研究中的应用基础
1.1 尿液多肽组学的技术平台及优势
毛细管电泳-质谱(capillary electrophoresis-mass spectrometry,CE-MS)、液相色谱-质谱(liquid chromatography-mass spectrometry,LC-MS)和基质辅助激光解吸电离-质谱(matrix-assisted laser desorption/ionization-mass spectrometry,MALDI-MS)是肽组学研究中应用最为广泛的3种质谱技术
[26],实验流程如
图1所示。
其中,毛细管电泳-质谱联用技术(CE-MS)作为主流检测手段,因其具备高分辨率、高重现性和高通量的特点,被广泛应用于尿液多肽的检测与分析。该技术能够在复杂的尿液基质中有效分离和鉴定低丰度、多样化的多肽分子,特别适合捕捉低分子量肽段,这对于揭示肾脏疾病的分子机制及寻找早期生物标志物至关重要
[27]。Hobson等
[28]利用CE-MS对317例早期与晚期慢性肾脏病患者的尿液样本进行分析,发现不同疾病阶段患者之间的差异肽表达模式存在显著差异,其中早期CKD快速进展者与缓慢进展者之间的差异胶原肽多达30条,而在晚期仅发现4条差异肽,提示早期肾脏存在可逆的结构重塑窗口期。Martin等
[29]应用CE-MS技术定量分析了CKD患者尿液中含C3M序列的胶原蛋白III型降解肽段的丰度变化,证实该肽段丰度与估算肾小球滤过率呈独立正相关,与肾间质纤维化和肾小管萎缩评分呈独立负相关,从而为胶原肽作为肾脏纤维化非侵入性生物标志物提供了直接证据。CE-MS是目前公认的尿液多肽组学“金标准”平台,其技术成熟度最高、验证性研究最为充分、跨中心可比性最强,尤其适合需要高精度定量和跨中心验证的大规模临床队列筛查。但其对操作人员的专业要求较高,且仪器设备和耗材成本相对昂贵,在资源有限的实验室直接推广存在一定门槛。
LC-MS因具备优越的色谱分离能力和与电喷雾电离的良好兼容性,能够实现对复杂生物样本中多肽的深度覆盖和全面鉴定。与CE-MS相比,LC-MS在肽段鉴定深度上具有一定优势,尤其适合未知肽段的发现性研究,并且可通过与代谢组学等其他组学进行串联,实现多维度分子信息的整合分析。Jiang等
[30]基于766名志愿者的尿液样本,构建了一个整合代谢组学与多肽组学的研究平台,其中多肽组学部分采用基于多孔硅的MALDI-MS平台完成,而代谢组学与LC-MS结合完成,该研究通过机器学习算法建立了糖尿病肾病的三步诊断模型,在外部验证中对健康对照的分类准确率达89.9%。此外,采用靶向LC-MRM MS策略的研究也可在CKD患者尿样中可靠地定量检出138种差异表达蛋白
[31]。LC-MS在研究目标不仅限于预先选定的已知肽段集,而是需要系统性发掘新的肽段标志物,或需结合代谢物和其他组学信息进行联合建模时,LC-MS的多维覆盖能力具有不可替代的优势。但需要注意的是,LC-MS的前端分离耗时相对较长,样本通量低于CE-MS,且对大型质谱仪的依赖性较强,设备成本同样较高。
MALDI-MS技术以其快速分析、操作简便、对样品纯度要求较低及高通量著称,特别适用于大样本量的临床队列筛查场景。MALDI-MS通常与飞行时间质量分析器联用(MALDI-TOF MS),能够在不经过复杂色谱分离的情况下直接对肽混合物进行检测,有效缩短了样品分析周期。Li等
[21]利用MALDI-TOF MS技术检测并建立了基于尿肽谱的CKD及IgA肾病快速诊断平台,将尿肽数据和机器学习相结合构建诊断模型,成功实现了CKD与健康对照的有效区分以及IgAN亚型与其他肾病的准确鉴别,展示了MALDI-TOF MS在肾病无创快速诊断中的临床转化可行性。MALDI-MS技术优势在于需要处理千例以上大规模临床样本进行初步筛查和分类,以及作为即时检测(point-of-care testing,POCT)的候选技术储备。但由于缺乏前端色谱分离,MALDI-MS对复杂样本中的低丰度肽段检测能力弱于CE-MS和LC-MS,且不同批次间的定量重现性相对较差,难以满足需要精确定量特定肽段的临床监测需求。
尿液作为样本在多肽组学研究中具有显著优势。首先,尿液采集非侵入性,便于反复采样,适合动态监测肾脏功能变化和疾病进展;其次,尿液中富含肾脏滤过后的多肽和蛋白质片段,能够直接反映肾脏的生理和病理状态,研究表明尿液中的多肽不仅包括胶原蛋白片段,还涵盖补体蛋白、免疫球蛋白等多种与肾脏疾病相关的分子
[32-33]。这些多肽的变化往往早于传统的血清学指标,体现出较高的敏感性和特异性,有助于早期发现肾脏损伤,尤其是在糖尿病肾病、肾小球疾病和CKD的早期阶段
[28,30]。此外,尿液来源的细胞外囊泡作为富含多肽和蛋白质的纳米载体,也被纳入多肽组学研究范畴,为肾脏疾病的精准诊疗提供了新视角
[34-35]。
1.2 多肽组学数据处理与机器学习方法
多肽组学数据处理是实现高效疾病诊断和精准治疗的关键环节,涉及数据预处理、特征提取、归一化以及后续的机器学习分析。由于多肽组学数据通常来源于复杂生物样本,且具有高维度和噪声特点,合理的数据处理策略能够显著提升后续模型的性能和可靠性
[36]。数据预处理通常包括背景噪声去除、信号峰的检测与对齐、缺失值处理等步骤,确保后续分析基于准确且一致的数据基础。特征提取则是从原始质谱数据中识别出具有生物学意义的多肽峰值,代表潜在的生物标志物。归一化方法用于消除不同样本间的技术变异和系统误差,使得不同样本的多肽表达水平可以进行直接比较
[37]。研究表明,通过MALDI-TOF-MS获取的血浆或尿液多肽组数据,经归一化处理后,能够更精准地反映疾病状态下的生物学变化
[38-39]。
机器学习算法在多肽组学数据的分类与预测中发挥着核心作用。支持向量机(support vector machine, SVM)由于其良好的分类性能和处理高维数据的能力,被广泛应用于疾病诊断模型的构建
[40]。利用SVM结合血清多肽指纹图谱,能够实现肝胰胆恶性肿瘤的高性能检测和亚型分类,准确率和特异性均超过90%
[41]。此外, UMAP(uniform manifold approximation and projection) 图是一种基于非线性降维的可视化方法,能够将高维多肽组数据映射至低维空间,保持数据的局部结构,便于可视化和后续的聚类分析
[42]。在CKD的尿液多肽组研究中,UMAP结合SVM实现了不同CKD病因的有效区分,为疾病分型提供了新的技术手段
[43]。这种降维与分类的结合,不仅提高了模型的判别能力,还促进了生物学特征的直观理解。
结合多肽组学和临床数据进行疾病分型和风险评估,展现了多模态数据融合的显著优势。通过整合多肽组学标志物与临床指标,机器学习模型能够更准确地预测疾病进展和患者预后。多肽组学与肠道菌群、转录组等多组学数据的融合分析,也有助于揭示CKD的病理机制,优化患者的个性化治疗方案
[44]。这种多维度、多数据源的机器学习方法,不仅增强了疾病分类的准确性,还加深了对疾病生物学本质的理解,为精准医疗提供了坚实的科学基础。
2 尿液多肽组学在CKD病因鉴别中的研究
2.1 多肽组学区分不同CKD病因的模型构建
通过高通量质谱技术,能够捕获尿液中大量的天然多肽信息,结合机器学习算法构建多病因区分模型,尤其在糖尿病肾病(diabetic kidney disease, DKD)、IgA肾病(IgA nephropathy, IgAN)及血管炎等不同CKD病因的鉴别诊断展现出巨大潜力。一项采用受试者尿液多肽组数据库数据开发的研究中,提取了1 850例健康对照组及CKD组,包含DKD、IgAN、血管炎尿液多肽数据,采用统一流形逼近与投影(UMAP)结合支持向量机(SVM)算法,成功构建了多类分类模型,实现了对DKD、IgAN、血管炎及健康对照组的有效区分。该模型在独立测试集中表现出70.13%的整体准确率,二分类模型,即DKD与健康对照组,准确率更高达90.35%。虽然引入UMAP降维步骤后准确率有所下降,但该步骤为不同病因的多肽数据在三维空间中的可视化提供了直观优势,便于临床解释和模型优化
[44]。该研究首次将尿液多肽组学从传统的二分类诊断拓展至多病因同步鉴别,验证了多肽组学结合降维可视化技术处理多分类任务的可行性。然而,70.13%的整体准确率在临床决策中仍显不足,错误分类可能引发治疗延误;此外,该研究的训练和测试数据均来自同一数据库,缺乏外部独立的多中心验证,模型的普适性尚待证实。
在糖尿病肾病的尿液多肽组学研究中,通过去除高丰度蛋白,结合纳升级液相色谱-质谱(nano LC-MS)定性定量分析,筛选出差异表达的尿蛋白。随机森林算法最终选出ACP2、CTSA、GM2A、MUC1和SPARCL1共5种蛋白构建多变量分类模型,显著优于单一白蛋白指标对DKD预后的预测能力,AUC值达0.935,显示多肽组学结合机器学习具有较强的疾病预后判别能力
[45]。此类多蛋白模型为糖尿病肾病患者提供了更精准的风险分层,辅助临床个体化治疗方案的制定。然而,该研究样本量较小,且未报告独立的外部验证队列结果,模型的过拟合风险尚不明确;第二,5种蛋白中包含MUC1和SPARCL1,这些蛋白的尿液丰度可能受到肾功能波动、尿路感染等非特异性因素的干扰,特异性需要进一步验证。
另一项基于基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF)技术的尿液多肽组学研究建立了针对CKD及IgAN患者的快速诊断平台,利用天然多肽谱的差异特征构建诊断模型,成功实现了CKD与健康对照及IgAN与其他肾病的区分。该模型通过多种机器学习算法的验证,表现出良好的鲁棒性和重现性,为无创筛查和早期诊断提供了有力工具
[21]。该研究证明了即使在较低分辨率的质谱平台上,尿液多肽谱依然携带足够的疾病鉴别信息,这为资源有限的医疗机构开展肾病无创筛查提供了技术可能性,但MALDI-TOF更适合作为初筛工具,再用CE-MS或LC-MS对这些样本进行精确定量和验证,这种两阶段策略可能是平衡成本与精度的现实路径。
2.2 特异性多肽标志物及其病理意义
多肽组学研究表明,尿液中胶原蛋白片段是最丰富且具有高度特异性的生物标志物之一,尤其是胶原蛋白III型的降解产物,其含量与肾小管间质纤维化呈显著负相关,且与肾小球滤过率呈正相关,反映了组织水平的纤维化进程和肾功能衰退状况
[29]。这些胶原蛋白片段的变化主要归因于蛋白质的羟基脯氨酸修饰,使其在质谱分析中曾被忽视。尿液中的多肽不仅反映了肾脏的纤维化和炎症状态,还为非侵入性监测肾脏病变提供了新的手段,替代传统的肾活检
[46]。
在遗传性肾病方面,常染色体隐性遗传多囊肾(autosomal recessive polycystic kidney disease,ARPKD)是一种严重的儿童期疾病。其诊断常因表型高度变异及与其他囊性肾病表型重叠而受阻,尤其在影像学表现不典型时,仅依赖
PKHD1基因检测难以满足快速无创筛查的临床需求。多肽组学技术对ARPKD患者的尿液多肽组进行了系统分析,纳入58例ARPKD患儿、662例其他病因CKD患儿及45例健康儿童,采用CE-MS技术鉴定出一条77肽特征谱,在匹配随机验证集中,该特征谱的灵敏度84.2%、特异性100%、AUC达0.994,显示出了优异的诊断性能。这一多肽组合不仅能区分ARPKD与其他肾病,还具有良好的诊断价值,为早期识别和疾病分型提供了重要依据
[22]。这些多肽大多涉及细胞外基质重塑、炎症反应及细胞信号调控,反映了ARPKD病理过程中的独特分子特征。本研究首次将尿液多肽组学拓展至先天性遗传性肾病这一相对少见的领域,验证了多肽组学在儿童罕见肾病诊断中的可行性。但罕见病本身收集困难,实际临床推广前仍需更大规模的独立外部队列验证。
另一项针对肾透析患者血清多肽的分离富集与质谱分析鉴定中,结合MALDI-TOF MS技术分析比较了健康对照、肾透析患者透析前后血清中肽段的指纹图谱,并利用LC-MS/MS技术初步比较了肾透析患者和健康对照血清的肽组,分别鉴定到8个和17个特异肽段,以及8个差异表达肽段。在肾透析患者血清中鉴定到的8个特异肽段分别来源于纤维蛋白原α链、组蛋白H2B 1-O型或1-H型、组蛋白H2B 1-K型、α-2-HS-糖蛋白、斑联蛋白、凝血因子XIII A链、补体C3。这些肽段揭示了肾脏病中凝血、补体和细胞损伤的交互网络,为进一步在大规模样本中验证具有临床诊断价值的肾病相关多肽生物标志物提供了基础数据
[47]。本次研究以MALDI-TOF MS进行肽谱筛查、以LC-MS/MS进行鉴定的双平台联用策略,兼顾了高通量筛查和深度鉴定的需求,展示了一种可供参考的技术路线设计。但研究发现的8个特异肽段,作为诊断标志物的敏感性和特异性未被量化评估,结论仅停留在鉴定出差异肽段的层面,未构建任何可供临床应用的分类模型,同样缺乏独立的验证队列。后续研究可考虑:①将候选肽段纳入独立的透析患者队列进行验证,并计算各肽段的AUC值;②对不同终末期肾病病因的透析患者进行分层分析,评估候选肽段在各亚型中的鉴别能力;③结合体外实验排除血液透析管路对凝血/补体通路的非特异性激活干扰,提高结果的特异性。
2.3 多肽组学辅助非侵入性诊断替代肾活检
肾间质纤维化和肾小管萎缩是CKD进展的关键组织学指标,传统的诊断依赖于肾活检,但肾活检具有侵入性强、风险性高且难以进行重复监测的缺点。一些难以耐受的幼儿、老年及肿瘤患者和抗拒肾脏穿刺的患者,可通过检测和分析尿液中的特定多肽谱,以预测慢性肾脏病患者肾间质纤维化和肾小管萎缩的程度,间接反映肾脏组织的病理状态,成为一种理想的替代方案。研究表明尿液中的胶原蛋白片段与肾脏纤维化程度密切相关,其含量显著降低且与肾小球滤过率呈正相关,与肾间质纤维化评分呈负相关,提示这些多肽可作为纤维化的潜在生物标志物
[29]。此外,尿液多肽组学还能捕捉小管损伤的分子特征,如长链脂肪酸转运蛋白2(solute carrier family 27 member 2, SLC27A2)和无羊膜蛋白(AMN)等,在高值正常组白蛋白尿患者中表达改变,反映早期肾小管功能异常
[48]。这些发现表明,尿液多肽组学不仅能评估肾间质纤维化和小管萎缩,还能实现疾病早期的无创监测和动态追踪。
一项研究通过CE-MS技术,对435名接受肾活检和肾病理学评估间质纤维化和肾小管萎缩的患者进行了尿液多肽组学分析,共鉴定出243种肽,纤维化组与非纤维化组之间存在显著差异,经过Benjamini-Hochberg校正,仍有29个具有显著意义的尿肽,这些肽段通过支持向量机算法整合,形成了名为纤维化肽谱FPP_29BH的分类器,能够有效区分有肾间质纤维化的患者与无纤维化患者。该分类器在独立队列中的验证显示,具有较高的灵敏度和特异性,ROC曲线下面积达到0.84,且分类器得分与肾间质纤维化和肾小管萎缩评分呈显著相关
[14]。FPP_29BH的构建逻辑与临床病理评价体系直接挂钩,且采用了严格的统计学多重校正和独立的验证队列,先用无创的多肽评分进行风险分层,对评分处于中间灰色地带的患者再行肾活检确认,从而在总体层面将肾活检需求降低30%~50%。具有临床转化潜力。此外,基于尿液多肽的机器学习模型也已被开发用于区分不同病因的CKD,如糖尿病肾病、IgA肾病等,实现对肾脏病理类型的非侵入性鉴别
[44]。这些分类器的临床应用前景广阔,有望减少肾活检的需求,降低患者风险,提高诊断效率。
3 多肽组学揭示的CKD病理机制与生物学意义
3.1 胶原蛋白及其降解产物在CKD中的作用
胶原蛋白片段是尿液多肽的核心组成部分之一,能够反映肾脏纤维化的进展过程。CKD常见的病理特征之一为肾脏纤维化,表现为肾脏中胶原蛋白的沉积和代谢异常,这些变化在肾组织水平上是疾病进展的标志,但血清肌酐、估算肾小球滤过率往往无法反映这些微观的组织学改变,通过毛细管电泳-质谱联用技术(CE-MS)检测尿液中的天然胶原蛋白片段,能够非侵入性地反映肾脏功能及纤维化程度。
有研究表明,胶原蛋白III型的降解产物,尤其是含有C3M序列的肽段,在CKD患者尿液中的含量显著减少,这些肽段的丰度与肾小球滤过率呈正相关,与肾间质纤维化和小管萎缩评分呈负相关,提示胶原蛋白III型的降解减少与肾功能下降和组织纤维化密切相关
[29]。此外,尿液中I型胶原蛋白α1链(collagen type I alpha 1,COL1A1)肽段的降解过程也显示出分阶段的调控特点,CKD患者在胶原蛋白降解的早期阶段肽段表达普遍下调,反映了内肽酶介导的胶原蛋白降解活性减弱
[18]。
尿液中胶原蛋白肽段的表达不仅与CKD进展相关,还受到年龄的影响。研究发现,大多数与eGFR高度正相关的COL1A1肽段表达随年龄增加而下降,表明年龄相关的胶原蛋白降解减少可能是促进纤维化和肾功能衰退的重要机制
[49]。在IgA肾病患者中,血清和尿液中测量三种胶原蛋白III型生物标志物C3M、C3C和PRO-C3,尿液中C3M/肌酐比值与肾组织纤维化程度呈负相关,而血清中的PRO-C3则与纤维化程度正相关,提示不同胶原蛋白片段反映了肾纤维化不同病理过程的信息
[50]。
这些研究从蛋白酶学角度提出了一个重要概念,CKD肾纤维化的本质可能主要不在于胶原蛋白的过度合成,而在于其降解能力的受抑制,为探索“激活内源性胶原降解通路”等新策略提供了理论基础。尽管上述研究都观察到了胶原蛋白肽段的丰度变化,但目前仍以关联分析为主,缺乏功能验证实验来确认这些变化与纤维化进程之间的因果关系。
3.2 相关蛋白酶及其调控网络
蛋白酶在多肽的生成过程中起着关键作用,尤其是在CKD相关的肾脏病理变化中。有研究用Proteasix(www.proteasix.org)等生物信息学工具,对参与多肽生成的蛋白酶进行预测和筛选,有24种可能参与CKD相关肽内源性切割的蛋白酶,分为两类,基质金属蛋白酶MMPs,包括MMP9、MMP13、MMP2、MMP14、MMP3、MMP12、MMP8、MMP20、MMP1、MMP7、MMP26;丝氨酸蛋白酶,包括4种蛋白质转化酶:PCSK6、PCSK7、PCSK4、PCSK5,和激肽释放酶4(Kallikrein 4,KLK4)。多肽的产生与这些蛋白酶的活性密切相关,MMP7、MMP14和PCSK5等在CKD的尿液多肽生成中占据重要地位,且MMPs家族成员不仅能够降解胶原蛋白和其他基质蛋白,还能影响炎症因子的活性,调节免疫反应和细胞迁移
[17]。在心肾综合征(cardio-renal syndrome,CRS)患者中,尿液多肽组学分析同样显示MMP9、MMP13及其他蛋白酶广泛参与了多肽的切割过程,推测这些蛋白酶在疾病进展中的作用不可忽视
[51]。此外,蛋白酶的活性与其对应的抑制剂共同维持肾脏微环境平衡,失调将导致纤维化加剧和慢性炎症状态的持续,促进CKD的进展。上述研究应用生物信息学工具反向预测多肽来源的蛋白酶,并结合CKD转录组数据进行交叉验证,为揭示蛋白酶-多肽调控网络提供了系统性策略,但当前结论主要基于计算机预测和相关性分析,缺乏直接的因果验证,这限制了结论的临床转化价值。
针对MMP-2、MMP-7、MMP-9、ADAM10和ADAM17的靶向抑制剂正逐渐被开发,既有广谱金属蛋白酶抑制剂,也有更为特异的抗体抑制剂,后者有望减少早期广谱抑制剂的毒副作用并提高安全性,这些进展为蛋白酶抑制剂的临床应用奠定了坚实基础
[52]。此外,特定蛋白酶抑制剂在慢性肾脏病相关的特殊病理状态下展现出独特的治疗潜力。研究发现分泌性白细胞蛋白酶抑制剂(secretory leukocyte peptidase inhibitor, SLPI)作为一种多功能丝氨酸蛋白酶抑制剂,在急性肾损伤(acute kidney injury,AKI)和糖尿病肾病中表现出早期诊断和预后价值。临床数据显示,AKI患者急性期血清SLPI显著升高,且重症患者中SLPI水平与肾功能恢复相关,重组SLPI在多种AKI模型中能缓解肾功能障碍,提示SLPI不仅是生物标志物,亦具有潜在的肾脏保护作用
[53-54]。蛋白酶抑制剂的药物开发还包括针对肾脏特异性蛋白酶的治疗策略,研究发现肠肽酶抑制剂SCO-792通过抑制肠道蛋白酶活性,减少蛋白质消化吸收,进而改善CKD模型大鼠的肾小球滤过率下降和纤维化,显示出新的治疗机制和潜力
[55]。
4 多肽组学与多组学数据整合在CKD中的应用
4.1 尿液多肽组与临床指标的联合分析
将尿液肽组数据与传统临床指标如血清尿素氮、血红蛋白及蛋白尿等变量相结合,有助于提升患者的疾病分层精度和预后评估的准确性。血清尿素氮作为肾功能的重要指标,其水平的升高往往与肾小球滤过率下降密切相关,但其单独使用在早期CKD诊断中的敏感性有限。蛋白尿则反映了肾小球滤过屏障的损伤程度,是CKD进展的独立危险因素。血红蛋白水平的降低则提示肾性贫血的发生,反映了肾脏的造血功能障碍。将这些临床指标与尿液中的特异性肽段联合分析,能够捕捉到肾脏结构和功能的多维变化信息,从而更全面地评估患者的病情。研究发现尿液肽段与肾脏纤维化、炎症反应及基底膜损伤相关联,这些肽段的表达水平变化与蛋白尿和血清指标呈显著相关,提高了疾病早期识别的灵敏度和特异性
[56]。
多维数据融合技术的发展,使得尿液肽组数据与临床变量的结合更加高效与精确。通过机器学习和多变量统计模型,如随机森林、支持向量机(support vector machine, SVM)及多反应监测质谱(multiple reaction monitoring,MRM)等方法,能在大规模数据中挖掘出关键特征肽和临床指标组合。研究表明利用尿液蛋白质组学与血清代谢组学数据联合构建的模型,已成功区分不同CKD阶段的患者,并预测疾病进展风险,显示出优于传统单一指标的诊断价值
[57-58]。此外,联合分析能够识别出反映肾脏损伤机制的生物标志物,如尿液中胶原蛋白片段、炎症相关蛋白及细胞外基质重构相关肽段,这些肽段与临床指标的联合变化为疾病的精准分期和个性化治疗提供了有力支持
[59]。
结合临床指标与尿液肽组数据亦促进CKD患者的风险分层和预后判断。尿液中的肽组模式与尿蛋白排泄量、血红蛋白水平及肾功能指标交互作用,可以预测患者对治疗的反应以及疾病的进展速度。在系统性红斑狼疮肾炎和糖尿病肾病等特定亚型中,联合分析已被证实能够更好地反映病理活动度和慢性损伤程度,辅助临床决策
[60-61]。
4.2 多肽组学与肠道微生物组的联合研究
肠道微生物群在CKD的发病机制中扮演着重要角色,肠道菌群失调常被认为是CKD进展的关键因素之一。近年来,肽组学与肠道微生物组的联合研究成为揭示CKD病理机制的新兴方向。尿液肽谱作为无创生物样本,能够反映肾脏和全身代谢状态的变化,而肠道微生物组的结构和功能变化则影响宿主的代谢和炎症状态,两者的整合分析有助于全面理解CKD的分子病理过程。
肠道菌群失调与尿液肽谱变化密切相关。研究表明,CKD患者的肠道微生物群表现出显著的群落结构变化,有益的短链脂肪酸(short chain fatty acid, SCFA)产生菌如
Roseburia、
Butyricicoccus等丰度降低,而与炎症相关的菌群如
Enterobacteriaceae丰富度增加。这种菌群失衡导致有害代谢产物如尿毒素的积累,促进肾脏炎症和纤维化。同时,尿液肽组学分析揭示CKD患者尿液中胶原蛋白源性肽段显著变化,反映肾脏组织重塑和损伤的过程。这些尿液肽谱的变化与肠道菌群的特征存在内在联系,提示肠道菌群代谢产物可能通过调控宿主蛋白表达和降解影响尿液肽谱
[44]。
5 多肽组学指导的个体化治疗与预后评估
在高危人群中,尤其是糖尿病患者,利用尿液肽谱分类器对个体进行风险评估,可以有效区分低风险与高风险群体
[62]。糖尿病作为糖尿病肾病和心血管疾病的重要前驱状态,传统的临床指标往往难以准确预测疾病进展,而尿液肽谱则反映了肾脏及血管的微观功能变化,为早期干预提供了重要依据。在糖尿病患者中,尿液肽组学通过采集和分析大量多肽特征,构建分类模型,可识别出潜在即将发展为糖尿病肾病或伴发心血管并发症的高风险个体
[63]。尿蛋白质组学结合家庭血压远程监测医疗改革(UPRIGHT-HTM)是一项由研究者发起的为期5年的临床试验,该研究是首次将尿液肽组学与家庭血压远程监测相结合的随机对照试验,旨在比较“家庭血压远程监测+尿肽组”与“单独家庭血压远程监测”在指导无症状但伴有≥5个心血管风险因素的55~75岁患者治疗中的效能。试验中展示了在多种族、高中低收入环境中实施风险分层的可行性,并为个性化预防提供了数据支持。该研究表明,肽谱信息与血压监测数据结合使用,可实现对心血管及肾脏风险的动态监控和精准管理,显著提升了风险识别的敏感性和特异性
[64]。
此外,多肽组学分类器在预测糖尿病肾病及相关心血管并发症风险方面表现出显著优势。慢性肾脏病患者心血管事件的发生率极高,传统风险评分模型常常低估风险。通过蛋白质组学技术开发的蛋白质风险评分(protein risk score, ProRS)模型,招募了1 799名无心血管病史的慢性肾病患者,分析和评估了2 920种血浆蛋白质,经弹性网络(elastic net)模型筛选出34种蛋白质在内的多维数据,可显著改善对CKD患者未来心血管事件的预测能力,优于传统临床风险模型和多基因风险评分
[65]。这一模型不仅能识别出极高风险患者,还能排除低风险个体,为临床决策提供有力支持。
6 结论
多肽组学作为蛋白质组学的重要分支,通过系统研究生物体内全部内源性多肽,为慢性肾脏病的机制探索与临床诊疗提供了新的视角。质谱技术的进步极大地推动了多肽的鉴定与定量,使得从血液、尿液等体液中筛选与CKD发生发展相关的差异表达多肽成为可能。这些多肽片段作为蛋白质水解加工的产物,有望成为新型、无创的疾病诊断与预后生物标志物。
然而,尽管近十年来尿液多肽组学在CKD领域取得了令人瞩目的进展,当前研究仍面临多重核心难点,这些难点正是制约该领域从“差异筛选”走向“临床转化”的关键瓶颈。第一,检测灵敏度与低丰度肽的覆盖瓶颈。CKD早期病理变化往往伴随极微量多肽的异常表达,而现有质谱平台对低丰度肽段,特别是亚纳摩尔级别以下,检出能力仍然有限。高丰度蛋白的信号压制效应、肽段离子化效率的差异以及动态范围的限制,导致大量潜在的低丰度生物标志物被遗漏。这是当前研究中假阴性风险的主要来源之一。第二,多肽提取与定量的标准化缺失。从样本采集、肽段提取到质谱数据采集和数据处理,各实验室间的操作流程高度异质,导致了跨研究、跨中心的结果不可比性。第三,研究成本高与机制深度不足的悖论。高通量质谱设备及稳定同位素标记内标等高精度定量方案的成本较高,使得多数研究局限于小样本、回顾性、单中心设计,样本量通常在几十至数百例之间。同时多数研究停留在“差异肽筛选”的描述性阶段,对差异肽的来源蛋白酶、生成机制及其与CKD病理进程的因果关系缺乏深入探讨。第四,独立前瞻性验证的严重缺位。尽管已有大量回顾性研究报道了高AUC的诊断或预测模型,但通过大规模、多中心、前瞻性队列进行独立验证的案例屈指可数。这种“高发现率、低验证率”的现状使得绝大多数候选标志物停留在论文阶段,无法进入临床检验目录。
针对上述核心难点,未来的研究需从以下4个方向重点突破。
(1)从回顾性发现到前瞻性验证的跨越。 应优先推动已报道的高性能多肽分类器进入多中心、大样本、前瞻性队列验证阶段,明确其在不同种族、不同CKD病因及不同疾病阶段人群中的泛化能力。
(2)多肽组学技术的标准化与质量控制体系建设。亟须建立从样本采集、肽段提取、质谱采集到数据分析的全流程标准化操作规范。标准化是实现多中心数据可比、结果可重复的前提,也是该领域走向临床的必经之路。
(3)低丰度肽检测新技术的开发与整合。应积极探索抗体或适配体富集、高场非对称波形离子迁移谱前端分离、新一代高分辨质谱等技术手段,提升低丰度肽段的检出率和定量准确性。同时,靶向多反应监测或平行反应监测策略可对候选肽段进行高灵敏度、高重现性的绝对定量,是验证阶段的重要补充手段。
(4)从关联分析到因果机制的功能验证。 针对已发现的差异肽段,应追溯其来源蛋白酶,并通过体外酶切实验、细胞水平过表达/敲低调控及CKD动物模型中特异性蛋白酶抑制剂干预等手段,验证特定蛋白酶-肽段轴与纤维化进展的因果关系。仅当分子机制被阐明,多肽标志物才可能从诊断工具升级为治疗靶点。
此外,应同步推动多中心临床样本库和长期随访数据库的规范化建设,加大对临床队列样本收集和多组学研究的技术研发和资金投入,深化临床到基础,基础到生物信息学的多学科交叉协作模式。同时,应积极探索成本更低、操作更简便且具备即时检测潜力的多肽检测新技术,降低技术门槛和经济成本,促进多肽组学技术在基层医疗机构的可及性和推广应用
[66]。
综上所述,多肽组学在CKD领域已从概念验证进入临床转化的关键攻坚阶段。若能在上述4个方向上持续推进,尤其是攻克低丰度肽检测、流程标准化、前瞻性验证等核心瓶颈,尿液多肽组学有望在未来五至十年内从研究工具真正转化为临床工具,助力实现CKD无创诊断、精准分型与个体化治疗的精准医疗目标。
国家中医药管理局高水平中医药重点学科(中医肾病学)建设项目(Zyyzdxk-2023210)
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