肝纤维化(hepatic fibrosis,HF)是指肝脏对酒精、病毒、血吸虫病等各种因素引起的肝损伤的一种修复反应,肝星状细胞(hepatic stellate cell,HSC)是产生细胞外基质(extracellular matrix,ECM) 的主要细胞
[1],肝纤维化主要表现为激活静止状态的HSC,从而导致细胞外基质(extracellular matrix,ECM)在肝脏中弥漫性过量沉积的一种过程
[2-3],HF还有可能转变成为肝硬化或肝癌
[4]。虽然当前已经有报道认为肝纤维化是可逆的,但是批准可用的药物仍较少
[5]。在晚期纤维化的情况下,唯一可用的治疗方法是肝移植
[6]。所以寻找新的治疗靶点和药物是必要的。
索拉非尼(Sorafenib)是经过美国食品和药物管理局批准的口服多激酶抑制剂,批准了用于治疗晚期肾细胞癌和不可切除肝细胞癌患者的药物
[7]。索拉非尼一种新型的分子靶向治疗药物
[8],它可以阻断受体酪氨酸激酶的信号通路,降低肝动脉中血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的活性,减缓新生血管的供氧和供血,抑制多种癌基因激酶活性
[9]。索拉非尼还可通过其他途径抑制细胞增殖的多种蛋白表达水平,减轻细胞毒性,加速肝功能的修复过程。最近有证据表明索拉非尼可以显著延缓CCl
4诱导的肝纤维化
[1]。而索拉非尼也被证实可以调节VEGF信号通路
[10]。
为了更好地探索索拉非尼对肝纤维化相关的作用机制,为药物的进一步开发提供参考,现以索拉非尼为主要干预手段,对CCl4诱导的肝纤维化大鼠进行干预,以水飞蓟宾为阳性对照组。通过观察干预后的肝脏表现及相关指标进行分析,初步探讨索拉非尼对HF大鼠的改善作用及机制,旨在为挖掘HF的潜在药物奠定基础。
1 材料与方法
1.1 主要仪器
快速湿转仪,购自金斯瑞生物科技股份有限公司;Multiskan FC酶标仪,购自美国Thermo Fisher Scientific公司;H1-16KR台式高速冷冻离心机,购自湖南可成仪器设备有限公司;全自动生化分析仪,购自深圳雷杜生命科学股份有限公司;化学发光成像系统,购自杭州申花科技有限公司。
1.2 主要药品及试剂
水飞蓟宾胶囊(每粒含水飞蓟宾35 mg, 批号:350708053),购自天津天士力圣特制药有限公司。甲苯磺酸索拉非尼片(规格:0.2 g/片,批号:23071200),购自重庆药友制药有限责任公司。VEGF、核因子κB(nuclear factor-κB,NF-κB)p65、转化生长因子β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)、核因子κB抑制蛋白α(inhibitor of NF-κBα,IκBα)抗体均购自武汉三鹰生物技术有限公司(批号分别为66828-1-Ig 、10745-1-AP、21898-1-AP 、10268-1-AP);α平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle action,α-SMA)抗体购于英国Abcam公司(批号Ab124964);TNF-α抗体购于上海碧云天生物技术股份有限公司(批号AF8208);磷酸化NF-κB p65(p-NF-κB p65)、低氧诱导因子1α(hypoxia-inducible factor-1α, HIF-1α)抗体,购于江苏亲科生物研究中心有限公司(批号分别为AF2006、AF1009);羟脯氨酸(hydroxyproline,HYP)测定试剂盒购于南京建成生物工程研究所有限公司(批号A030-2-1);丙氨酸转氨酶(alanine aminotransferase,ALT)、天冬氨酸转氨酶(aspartate aminotransferase,AST)测定试剂盒购于深圳雷杜生命科学股份有限公司(批号分别为S03030、S03040);TNF-α、白细胞介素17(interleukin-17,IL-17)、IL-1β、IL-6、Ⅲ型前胶原肽(procollagen typeⅢ,PCⅢ)、Ⅳ型胶原(Ⅳ-collagen,Col Ⅳ)、层黏蛋白(laminin,LN)、透明质酸(hyaluronic acid,HA) 酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)试剂盒购于江苏酶免实业有限公司(批号分别为MM-0180R1、MM-0088R1、MM-0047R1、MM-0190R1、MM-20645R1、MM-61483R1、MM-0852R1、MM-0511R1);α-SMA抗体购于武汉塞维尔生物科技有限公司(批号为GB111364)。
1.3 实验动物
SD雄性大鼠[SPF级,体重(200±20)g,6~8周龄]由贵州中医药大学动物研究所提供。生产许可证为:scxk(黔)2021-0003,动物的喂养及实验全程均在标准动物房进行,严格遵守“3R”原则。本研究通过贵州中医药大学伦理审查会审查,批准号为20240901002。
2 研究方法
2.1 动物分组与造模
大鼠适应性饲养1周后随机分成4组,其中对照组、模型组各7只,水飞蓟宾组与索拉非尼组各6只。模型组、水飞蓟宾组、索拉非尼组大鼠予3 mL/kg的CCl
4橄榄油混合液(体积比2∶3)腹腔注射,对照组也予3 mL/kg的生理盐水橄榄油混合液(体积比2∶3)腹腔注射,均每周注射2次(周一、周四),持续8周
[11]。待8周结束后,随机取对照组、模型组大鼠各一只,用颈椎脱臼法处死,均采取适量新鲜肝右叶组织进行苏木精-伊红(HE)和马松(Masson)染色,以《肝纤维化中西医结合诊疗指南(2019年版)》推荐的Meatavir评分
[12]为标准,评判是否造模成功。
2.2 给药与取材
根据分组给大鼠进行不同药物的灌胃治疗,其中模型组与对照组予生理盐水灌胃,各组大鼠灌胃体积均定为10 mL/kg,灌胃持续30 d,每天灌胃1次。索拉非尼根据说明书推荐剂量为正常人0.8 g/d,根据体表面积换算法得出大鼠用药为0.072 g/kg
[13]。同理水飞蓟宾成人剂量换算成大鼠给药剂量为18.9 mg/kg。
干预结束后,大鼠禁食不禁水12 h并称重,给大鼠腹腔注射舒泰50(50 mg/kg)进行麻醉,麻醉后通过腹主动脉取血并离心出血清保存在-80 ℃冰箱。颈椎脱臼法处死大鼠后取新鲜的肝组织并称重,切取新鲜的肝右叶组织,其中一部分固定在4%多聚甲醛中,另一部分肝组织冻存于-80 ℃冰箱中,用于后续检测。
2.3 检测大鼠血清ALT、AST、HYP水平
根据试剂说明书,用全自动生化仪对大鼠进行ALT、AST、HYP水平的检测。
2.4 ELISA法对大鼠血清中炎症因子、肝纤四项水平检测
按照试剂说明书,采用酶联免疫吸附对大鼠血清中TNF-α、PCⅢ、 IL-17、LN、 IL-1β 、Col Ⅳ、IL-6、HA水平检测。
2.5 肝组织病理检测
将经过4%多聚甲醛处理的各组大鼠肝脏进行脱水、透明、浸蜡、切片等操作后进行苏木精-伊红(HE)染色或Masoon染色。
2.6 肝组织TGF-β1和α-SMA表达水平检测
采用免疫组化法进行检测。取经4%多聚甲醛处理的大鼠部分肝脏(每组选4只大鼠的肝组织),经过与HE染色流程一样处理后,把切片放在烧杯里并加入EDTA缓冲液,修复15 min。用3%的过氧化氢滴在玻片上15 min以阻断内源性过氧化氢酶。然后在玻片上加入山羊血清封闭30 min。血清封闭后,加入TGF-β1和α-SMA一抗(稀释比分别为1∶100和1∶200),4 ℃孵育15 h,加酶标二抗37 ℃孵育。加入DAB显色液着色后,再加Mayer苏木素复染。最后脱水、封片、镜下拍照。
2.7 大鼠肝脏组织中NF-κB、VEGF通路相关蛋白表达检测
取冻存于-80 ℃冰箱中的少量肝组织裂解30 min后,放入4 ℃下12 000 r/min离心5 min,取上清。进行蛋白浓度测定及变性处理,把准备好的胶放到电泳槽,把40 μg 蛋白样品和Marker 上样后电泳(恒压180 V,电泳时间 40 min),转膜至PVDF膜。封闭后加入一抗,GAPDH、VEGF、HIF-1α、IκBα、p-NF-κB p65、NF-κB p65、TNF-α、α-SMA一抗(稀释比例分别为1∶10 000、1∶3 000、1∶1 000、1∶10 000、1∶1 000、1∶5 000、1∶1 000、1∶30 000)浸泡PVDF膜,在4 ℃环境下过夜。洗膜5次,每次5 min,然后加入相应二抗(稀释比例为1∶10 000),把PVDF 膜浸泡在二抗中,室温孵育2 h。洗膜后用ECL 试剂(AB 按照比例1∶1 混合)200 μL 均匀覆盖在膜上,自动曝光,利用Image Pro Plus 6.0 软件对条带灰度值进行分析。用目标蛋白与内参蛋白条带灰度值的比值表示以上蛋白的水平,用 p-NF-κB p65和NF-κB p65灰度值比值来表示磷酸化的水平。
2.8 统计学方法
使用SPSS 29.0软件进行统计分析。符合正态分布的定量资料以平均值±标准差($\stackrel{-}{\mathit{x}}\pm \mathit{s}$)表示,组与组之间采用单因素方差分析,若方差齐则用LSD-t检验,方差不齐则用Tamhane’s T2检验;P<0.05为差异具有统计学意义。
3 结果分析
3.1 索拉非尼对肝纤维化大鼠血清炎症因子、肝纤维化四项的影响
和对照组比较,模型组大鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-17、PCⅢ、Col Ⅳ、LN、HA的含量均有明显上升(
P<0.01)。与模型组相比,水飞蓟宾组与索拉非尼组的以上指标血清含量均明显下降(
P<0.01),结果如
表1和
表2所示。
3.2 索拉非尼对肝纤维化大鼠血清中ALT、AST、HYP水平的影响
和对照组比较,模型组大鼠血清中ALT、AST、HYP含量明显增加(
P<0.01)。和模型组比较,水飞蓟宾组与索拉非尼组的以上指标血清含量均明显降低(
P<0.01),结果如
表3所示。
3.3 索拉非尼对肝纤维化大鼠组织病理的影响
3.3.1 HE染色结果
对照组大鼠肝组织结构较为完整,未见明显炎症细胞浸润及肝细胞脂肪变性。模型组大鼠肝细胞排列紊乱,汇管区结缔组织显著增生,可见较多炎症细胞浸润,肝细胞明显水肿及变性。给药组相对于模型组,炎症细胞浸润明显改善,肝细胞水肿减轻,可见结缔组织轻度增生,如
图1所示。
3.3.2 Masson染色结果
对照组大鼠肝小叶结构完整,仅有少量蓝色胶原纤维沉积。模型组大鼠汇管区可见明显蓝色胶原纤维增粗,粗纤维间隔形成。给药组相对模型组,纤维化程度均有不同程度缓解。与对照组0.05%±0.00%相比,模型组大鼠Masson染色阳性面积比1.71%±0.28%明显增高(
P<0.01)。与模型组比较,水飞蓟宾组(0.37±0.13)%与索拉非尼(0.57±0.20)%组明显减轻(
P<0.01)。组间差异通过单因素方差分析(
F=45.698,
P<0.01),如
图2所示。
3.4 索拉非尼对肝纤维化大鼠组织中α-SMA、TGF-β1表达的影响。
对照组α-SMA、TGF-β
1检测均可见少量着色,α-SMA的表达主要集中于小动静脉的血管壁,而TGF-β1的表达多数集中在肝细胞中,其余未见明显表达。模型组α-SMA、TGF-β
1检测均可见大量高表达。和对照组相比,模型组的α-SMA、TGF-β
1表达显著上调(
P<0.01);和模型组相比,水飞蓟宾组与索拉非尼组α-SMA、TGF-β
1表达明显减少(
P<0.05或
P<0.01);如
图3、
图4和
表4所示。
3.5 索拉非尼对HF大鼠中α-SMA以及VEGF通路、NF-κB通路相关蛋白表达的影响
和对照组比较,模型组的NF-κB p65蛋白磷酸化水平以及TNF-α、α-SMA、HIF-1α、VEGF的蛋白表达水平均有明显增加(
P<0.05或
P<0.01),而IκBα蛋白表达水平明显下调(
P<0.01)。与模型组相比,索拉非尼组和水飞蓟宾组的NF-κB p65蛋白的磷酸化水平以及TNF-α、α-SMA、HIF-1α、VEGF的蛋白表达水平均有明显下调(
P<0.05或
P<0.01),而IκBα蛋白表达水平明显上升(
P<0.05或
P<0.01)。结果如
图5和
表5所示。
4 讨论与结论
炎症和缺氧是诱导新生血管形成的关键因素,而炎症和新生血管生成又都能诱发和加重肝纤维化
[14]。炎症、缺氧、新生血管、肝纤维化常常相互纠结与相互影响
[15],在慢性炎症过程中,炎症细胞的积聚和纤维化可能通过增加受损组织对血流和氧气的阻力而导致缺氧,另一方面,缺氧在刺激血管生成中是十分重要的,也可以刺激炎症,导致炎症和血管生成之间的循环
[14]。
核转录因子κB (nuclear factor-κB,NF-κB)通路与炎症反应密切相关, HSC是产生ECM的主要细胞,ECM在肝脏中弥漫性过量沉积则会发展成肝纤维化,而NF-κB的通路活化主要存在HSC之中
[16]。
有研究表明抑制活化的NF-κB可以改善肝纤维化
[17]。因此NF-κB信号通路是抗炎治疗与抗肝纤维化的潜在靶点。NF-κB家族包括p50、p52、p65(RelA)、RelB、c-Rel。经典途径是在肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素1(IL-1)等刺激下,激活ⅠκB激酶复合物(Ⅰ-kappa B kinase, ⅠKK),使IκB磷酸化,释放NF-κB二聚体(p65/p50),二聚体可以和其他转录因子组合或者单独入核进行调控
[18-19]。缺氧是引起血管新生的重要原因,缺氧诱导因子(hypoxia-inducible factor,HIF)是由α和β亚基两者组成,但α亚基在缺氧下比较稳定,不易羟基化,反之在有氧情况下容易降解,所以在低氧情况下HIF-1α含量会出现升高现象
[20]。HIF-1α是调节氧代谢的重要转录因子,在缺氧情况下与HIF-1β结合成HIF-1复合物进行表达。肝纤维化进展时大量的ECM沉积于窦周隙,使得肝细胞与血浆中物质交换与氧气获取出现障碍,最后出现假性缺氧状态
[21]。缺氧使得HIF-1α表达更为活跃,而HIF-1α又能进一步激活HSC,加重肝纤维化。
以HIF为中心的缺氧信号通路的激活可以启动免疫炎症反应,缺氧和炎症中转录反应的关键调节因子分别是HIF和NF-κB
[22]。但是NF-κB、HIF-1并非相互独立,而是相互作用。NF-κB的活化可提高多种细胞系中HIF-1α的mRNA和蛋白水平,NF-κB的p65和p50亚基与HIF-1α启动子结合,可上调HIF-1α表达
[23],HIF-1还促进NF-κB表达和转录活性
[24]。王小天等
[25]认为,在缺氧环境下,如果没有NF-κB,HIF-1α基因也无法转录, 所以HIF-1α主要受NF-κB调控。符智慧等
[26]发现低氧条件下的脂多糖可通过激活NF-κB诱导HIF-1α表达,并通过加入NF-κB抑制剂进行观察,发现加入抑制剂后HIF-1α mRNA表达显著减少。Jin等
[27]发现低密度脂蛋白(low-density lipoprotein,LDL)通过下调TNF受体以及经典和非经典NF-κB途径的多个关键组分,破坏TNFα/NF-κB/HIF/VEGF信号级联,从而减弱缺氧诱导的血管生成,证明了存在介导微血管生成TNF-α/NF-κB/HIF/VEGF信号通路。HIF-1α调控NF-κB通路的研究相对较少
[28]。有学者认为在缺氧环境里,随着HIF-1α积累而激活NF-κB通路
[29]。朱婷婷等
[30]通过对天冬多糖的研究发现,可以通过调节HIF-1α/VEGF/NF-κB信号通路抑制肝癌细胞的增殖和血管生成。
通过研究炎症、缺氧、新生血管密切相关的TNF-α/NF-κb通路与HIF-1α/VEGF通路,对索拉非尼与肝纤维化之间的作用机制进行探究。PCⅢ、Col Ⅳ、LN、HA作为常见的检测肝纤维化的重要指标
[31],而 HYP是胶原组织的主要成分之一,α-SMA表达水平增高反应HSC的增加
[32],在一定程度这些指标均可以体现肝脏纤维化程度,研究发现给药后大鼠血清中PCⅢ、ⅣC、LN、HA、HYP水平显著降低,α-SMA表达也明显下降,说明索拉非尼可以缓解或改善肝纤维化。结果表明,索拉非尼能够显著降低IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-17、ALT及AST等炎症相关指标,有效减轻肝脏炎症并改善肝功能。通过检测TNF-α/NF-κb通路与HIF-1α/VEGF通路相关指标发现,索拉非尼具有抑制TNF-α/NF-κb和HIF-1α/VEGF通路激活的作用。
综上所述,索拉非尼具有改善大鼠肝功能、缓解大鼠肝纤维化的作用,其机制可能与抑制TNF-α/NF-κb通路与HIF-1α/VEGF通路的激活有关。
国家中医药管理局第五批全国中医临床优秀人才研修项目(国中医药人教函[2022] 1号)
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