Ⅱ型糖尿病(type Ⅱ diabetes mellitus,T2DM)属于代谢性疾病范畴,其特征为血糖稳态失衡,由遗传、环境等多种因素共同诱发。其病理机制主要涉及胰岛素抵抗(insulin resistance,IR)和胰岛细胞功能障碍,导致机体对胰岛素的利用效率显著下降
[1]。据统计,糖尿病患者在全球范围内超过5亿,患病率达到了6.1%
[2]。其中,中国糖尿病患者人数已占全球总病例数的25%,且这一比例在未来数十年仍将持续攀升。该疾病不仅对人类健康构成重大威胁,同时也给社会和家庭造成了巨大的经济及心理压力。当前治疗糖尿病的手段主要依赖胰岛素及控制饮食,但存在显著局限性:胰岛素需长期注射且易引发低血糖风险,口服药物则可能引发消化系统副反应、肝肾代谢负担及药物敏感性衰减等问题。在此背景下,探索天然产物在糖尿病治疗中的潜力成为当前人们关注的热点问题。
虫草(
Cordyceps-like fungi)是一类主要寄生于节肢动物(包括昆虫、蜘蛛、螨虫等)、线虫、部分真菌(如大团囊菌
Elaphomyces)和植物的一类非单系的子囊真菌,具有营养、保健和医疗功效的宝贵生物资源
[3-4]。虫草作为中国传统药用生物资源最早记载于《神农本草经》
[5]。其主要功效成分包括核苷、生物碱、多肽、虫草素等
[6-9],现代药理学研究发现虫草提取物具有抗氧化、降血糖、抗炎、抗肿瘤等功效
[10-14]。
氧化应激作为糖尿病并发症发生的关键机制,因此针对氧化应激的抗氧化干预成为改善糖尿病并发症的有效途径之一。近年来,虫草类生物活性成分(如虫草素、虫草多糖等)在抗氧化及改善高血糖所致的病理损伤中的多途径调控作用备受关注。研究表明,蛹虫草提取物、冬虫夏草提取物及虫草素等活性成分在动物学实验中均表现出较好的抗糖尿病作用
[15-18]。
现有虫草属生物资源的药理功效研究多局限于冬虫夏草、蛹虫草及蝉花等常见物种,大量虫草菌株的生物活性潜力仍处于待发掘状态。针对这一研究缺口,现选取3株未被深度开发的虫草分离菌株开展系统性研究:首先通过大米发酵培养制备菌株提取物,完成抗氧化活性与α-葡萄糖苷酶抑制能力的双重活性筛选;继而锁定活性最优菌株,采用高效液相色谱-质谱联用技术(ultra-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry,UPLC-MS/MS)进行化学成分检测与鉴定。在此基础上,结合网络药理学预测与细胞实验验证,深入解析其降糖活性成分、核心作用通路及靶向调控机制。相较于以往聚焦单一活性评价或常见物种的研究,研究不仅极大拓宽虫草降糖药用资源的筛选范围,更凭借多技术整合的研究策略显著提升结论的科学性与机制阐释深度,为虫草属真菌在糖尿病防治领域的开发利用提供更为系统、可靠的理论支撑与实验依据。
1 材料与方法
1.1 材料、试剂与仪器
菌株:CGMCC 3.6521(简称 JX),购买于中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC),分离自江西绿僵菌Metarhizium jiangxiense;菌株:GZY_OXSY202201(简称 XF),分离自雪峰线虫草Ophiocordyceps xuefengensis,标本系代永东等于2022 年 7月采集自湖南邵阳县雪峰山;菌株:GZY_ORSF202218(简称 RS),分离自枝桠线虫草Ophiocordyceps ramosissimum,标本系常衬心等于2022年7月采集自云南水富县铜锣坝自然保护区。
细胞:人源肝癌细胞株HepG2购自中国科学院细胞生物学研究院。
乙腈(色谱级,上海星可高纯溶剂有限公司);甲酸(色谱级,Aladdin);甲醇(色谱级,Merck);阿卡波糖(上海源叶生物科技有限公司);二甲基亚砜(Dimethyl Sulfoxide,DMSO)(细胞级,北京索莱宝科技有限公司);2,2-二苯基-1-苦基肼基自由基清除能力检测试剂盒(2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl Radical Scavenging Assay Kit, DPPH)(北京索莱宝科技有限公司);2,2’-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸自由基清除能力检测试剂盒[2,2’-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) radical cation scavenging assay kit, ABTS](北京索莱宝科技有限公司);总抗氧化能力检测试剂盒(北京索莱宝科技有限公司);葡萄糖测定试剂盒、糖原测定试剂盒、磷酸盐缓冲液、细胞冻存液(北京索莱宝科技有限公司);胎牛血清、胰蛋白酶(以色列Biological Indudtries公司);DMEM培养基(美国GIBCO公司);山羊抗小鼠IgG、β-肌动蛋白(beta-actin, β-Actin)(江苏碧云天生物技术研究所)。
UPLC ExionLCTM AD超高液相色谱仪(SCIEX新加坡);QTRAP 4500质谱仪(sciex 新加坡);LDZX-50L高压蒸汽灭菌锅(上海申安医疗器械厂);ZWY-2102恒温培养振荡器(上海智域分析仪器有限公司);SPX-100B-Z生化培养箱(上海博远实业有限公司);EPOCH型多功能酶标仪(美国Thermo公司);5424R离心机(Eppendorf);MS105DM十万分之一电子天平(梅特勒托利多仪器有限公司);CCL-170B-8型细胞培养箱(新加坡ESCO公司);1658001电泳仪、GelDoc XR凝胶成像系统(美国Bio-Rad公司)。
1.2 虫草菌株的分离及鉴定
对野生虫草进行组织分离法纯培养,获得的纯化菌株接于PDA固体培养基中,25 ℃培养10 d,刮取菌丝后使用真菌基因组DNA提取试剂盒(TransGen)提取DNA。ITS序列的扩增及测序按课题组前期研究方法开展
[19]。将测序结果通过在线BLAST比对后,下载相似度高的物种序列,在本地完成序列比对,利用MEGA5构建系统发育树,完成物种的分子鉴定。
1.3 虫草菌株的培养及样品制备
将纯化菌株接种于PDA液体培养基,在25 ℃、150 r/min摇床振荡培养10 d制备种子液。随后,按10 mL/袋的接种量(每袋含50 g大米,50 g水,灭菌后)将种子液接入大米固体培养基。在室内静置培养30~40 d(温度25 ℃,相对湿度60%)。培养结束后,用乙酸乙酯/甲醇(9∶1,体积比)超声提取,40 ℃减压浓缩至浸膏状,冷冻干燥得虫草提取物。
1.4 抗氧化能力测定
参考王启明等
[20]的实验方法,按照试剂盒说明书稍作修改。
(1)DPPH自由基清除能力测定。3种虫草分离菌分别配制为50 mg/mL溶液,梯度稀释。样品溶液与等体积DPPH自由基溶液混合均匀后。置于25 ℃的避光环境中反应30 min,最后在515 nm波长下测定该反应体系的吸光值。
(2)ABTS自由基清除能力测定。3种虫草分离菌分别配制为5 mg/mL溶液,梯度稀释。10 μL样品溶液与170 μL的ABTS溶液混合均匀后,置于无光照条件下室温静置反应6 min,最后在405 nm波长下测定该反应体系的吸光值。
(3)总抗氧化能力测定。3种虫草分离菌分别配制为25 mg/mL溶液,梯度稀释。6 μL样品溶液与180 μL混合液充分混匀,室温(25 ℃)静置10 min后在593 nm波长下测定该反应体系的吸光值。
实验设置中,空白对照组采用工作液和蒸馏水的混合溶液,并以维生素C(ascorbic acid, AA)作为阳性对照。每组实验重复三次,分别测定DPPH和ABTS自由基清除率以及总抗氧化能力,用GraphPad Prism 8.0.2进行统计分析,并按下列公式计算相关指标。
DPPH (ABTS)自由基清除率%=[空白-(测定-对照)]/空白 ×100%;总抗氧化能力=测定-空白。
1.5 α-葡萄糖苷酶抑制试验
参照龙楚仪等
[21]方法,3种虫草分离菌分别配制为2 mg/mL溶液,梯度稀释。25 μL样品溶液与50 μL α-葡萄糖苷酶溶液混匀,置于37 ℃下预培养10 min,加入25 μL的PNPG,继续于37 ℃孵育5 min,最后再加入100 μL Na
2CO
3溶液(0.1 mol/L)停止反应进程,最后于405 nm波长下测定该反应体系的吸光值。以阿卡波糖为阳性对照,所有样品均设置3个重复,用GraphPad Prism 8.0.2进行统计分析,并按下列公式进行计算。
α-葡萄糖苷酶抑制率=[1-(样品测定组-样品空白组)/(对照组-空白组)]×100%。
1.6 江西青霉代谢产物检测及鉴定
将江西青霉提取物(1.0 mg)溶解于1.5 mL、20%乙腈甲醇混合液中,用0.22 μm微孔滤膜过滤,采用超高效液相色谱(ultra performance liguid chromatography,UPLC) (ExionLCTMAD)和串联质谱(tandem mass spectrometry,MS/MS)进行测定,运行条件:柱温40 ℃;流速0.35 mL/min;2 μL进样量。参数设置为:5% B(0 min)、5%~95% B(0~9 min)、95% B(9~10 min)、95%~5% B(10~11.10 min)、5% B(11.10~14 min)。
检测完成后,通过二级质谱数据结合MWDB化合物数据库进行物质鉴定,并采用三重四极杆质谱仪的多反应监测技术(multiple reaction monitoring,MRM)实现目标物的准确定量。
1.7 基于网络药理学对江西青霉提取物抗糖尿病作用的预测分析
1.7.1 靶点的获取
通过分析样本的二级质谱数据(包含所有碎片离子信息)及其保留时间(retention time,RT),与标准数据库进行比对,筛选出匹配度评分不低于0.7的潜在化合物。进一步采用TCMSP数据库(
https://oldtomsp-e.com/tcmsp.php)对初筛结果进行二次筛选,最终获得的化合物通过其CAS编号在PubChem数据库(
https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)中获得相应的SMLIE号。利用SWISS ADME(
http://www.swissadme.ch)数据库对检测到的化合物进行活性成分筛选,条件设定为:GI absortion为“high”,且druglike-ness指标中至少有2项结果为“Yes”。以“Probability>0”,且设定物种为人类,通过Swiss TargetPrediction(
http://swisstargetprediction.ch/)数据库预测江西青霉活性成分的作用靶点,并汇总靶点信息。
以“Type 2 diabetes mellitus”为检索词,分别利用Genecards(
https://www.genecards.org/)、TTD(
https://db.idrblab.net/ttd/)、OMIM(
https://www.omim.org)数据库搜索已报道的和T2DM相关基因,将各数据库预测的疾病靶点信息取并集
[22]。
将药物预测靶点和疾病靶蛋白导入微生信生物信息分析平台(
https://www.bioinformatics.com.cn/),利用平台工具制作韦恩交集图并提取T2DM-江西虫草共同靶点,得到两者交集靶点。
1.7.2 PPI网络图构建及通路富集分析
将筛选获得的共同作用靶点上传到STRING蛋白相互作用数据库,限定生物种类为人类,获取蛋白相互作用数据后以TSV格式导出。使用Cytoscape 3.10.2生物信息学分析工具处理互作数据,结合Network Analyzer扩展模块计算网络拓扑特征参数
[23]。筛选标准设定为:无向介数中心性(betweenness unDir)超过30.197,无向接近中心性(closeness unDir)高于0.001,无向度中心性(degree unDir)大于30.2。基于筛选获得的节点建立蛋白质相互作用(protein-protein interaction,PPI)网络模型,识别江西青霉调控T2DM的核心作用靶标。
进一步将筛选的共有靶标导入DAVID数据库中,进行Gene Ontology(GO)功能富集和Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG)通路分析,采用微生信平台对分析结果进行可视化处理
[24]。
1.7.3 “药物-成分-疾病-靶点-通路”网络构建
将39个活性成分、共同靶点以及基于KEGG通路富集分析获得的前20条通路数据导入Cytoscape 3.10.2软件中,构建“药物-成分-疾病-靶点-通路”网络图,利用“Network Analyzer”功能分析构建的网络。
1.7.4 分子对接
基于“药物-成分-疾病-靶点-通路”网络图,根据拓扑参数(Degree值)选取网络中度值较高的活性成分为配体,选取关键靶点中连接度最高的核心蛋白进行分子对接实验验证。首先在PubChem数据库获得配体3D结构。同时在PDB数据库选择核心蛋白的3D结构。运用MOE软件对蛋白受体进行预处理,并将其转换为pdb格式;同时将配体文件格式转换为mol 2格式。借助MOE软件将二者进行分子对接,以最低结合能作为对接结果。以结合能≤-20.93 kJ/mol为参考
[25],对结果进行系统性评估。
1.8 实验验证
1.8.1 IR-HepG2细胞实验
(1)分组:空白组(未处理细胞)、对照组、模型组、阳性组(二甲双胍10 mmol/L)、JX低中高3个剂量组分别为0.05、0.1、0.2 mg/mL(JX-L、JX-M、JX-H)。
(2)造模与给药:参考张敬升等
[26]方法稍作修改,取2 mL表面覆盖率达85%的细胞液接种于培养板中,加入0.8 mol/L的胰岛素溶液(含1%青-链霉素液与10%胎牛血清的高糖DMEM培养基)孵育24 h,构建模型组细胞。造模完成后,对细胞的葡萄糖消耗水平进行定量检测与计算,分析模型组和对照组的检测结果,判断细胞模型是否构建成功。
取合适量细胞接种于培养板中。模型组和各给药组加入造模液诱导IR-HepG2模型,空白组和对照组加入低糖DMEM培养基,培养24 h后,弃去培养板内的培养液,磷酸盐缓冲液洗涤3次,所有组加入等体积的血清和低糖DMEM培养基,终体积均为2 mL,各给药组和阳性组给药100 μL,另外3组(空白组、对照组和模型组)则补充100 μL低糖DMEM培养基,培养24 h。参考何茗苠等
[27]方法测定细胞葡萄糖消耗量、糖原含量。
1.8.2 蛋白免疫印迹技术检测PI3K、AKT、p-AKT、TNF-α蛋白水平
收集不同处理组的细胞样本,加入1 mL RIPA裂解液(RIPA∶PMSF∶磷酸酶抑制剂=100∶1∶1,体积比),提取总蛋白,以BCA法测定细胞蛋白浓度,并进行标准化处理。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、转膜、5%脱脂牛奶封闭2 h,加入稀释比例适宜的一抗(PI3K、AKT、p-AKT、TNF-α、β-actin),4 ℃孵育过夜,加入相应种属来源的二抗后洗膜3次,最后加入ECL化学发光底物进行显色反应,检测膜蛋白信号,使用Image J软件分析条带的灰度值。
2 结果与分析
2.1 3种虫草分离菌株鉴定
利用ITS序列对3种虫草分离菌株进行鉴定,结果如
图1所示。可以看出,菌株CGMCC 3.6521与
Penicillium jiangxiense的序列完全一致,菌株GZY_OXSY202201与
Ophiocordyceps xuefengensis的序列完全一致,GZY_ORSF202218与
Ophiocordyceps ramosissimum完全一致。由此,3个虫草分离菌株分别鉴定为江西青霉、雪峰线虫草、枝桠线虫草。
2.2 3种虫草分离菌株抗氧化能力分析
DPPH自由基清除能力测定结果[
图2(a)]显示,3种虫草分离菌均表现出DPPH自由基清除活性,且在3~50 mg/mL浓度范围内,清除率与浓度呈显著正相关。同一浓度下,江西青霉(JX)和枝桠虫草(RS)菌株的清除效能最强(
P<0.01),其半数抑制浓度(IC
50)分别为5.37 mg/mL和10.65 mg/mL。当浓度达到50 mg/mL时,JX和RS的清除率分别为100%和94.21%,与阳性对照AA效果相当;而雪峰虫草(XF)菌株的IC
50最高(801.6 μg/mL),抗氧化活性最弱。
ABTS自由基清除实验[
图2(b)]表明,3种菌株的清除率均随浓度升高呈典型的剂量依赖性增强。其中,JX和RS的清除活性显著优于XF(
P<0.01),IC
50分别为1.46 mg/mL和2.35 mg/mL。当JX浓度为5 mg/mL时,清除率达95.45%,与阳性对照接近;而XF的抗氧化性能相对较弱。
总抗氧化活性检测[
图2(c)]显示,在0.39~25 mg/mL浓度范围内,3种菌株的抗氧化能力均呈浓度依赖性提升。同等条件下,JX和RS的抗氧化性能显著优于XF(
P<0.01)。当浓度为25 mg/mL时,JX的抗氧化效果与AA相当,RS的效率达AA的92%。
2.3 α-葡萄糖苷酶抑制试验
对3株虫草分离菌的α-糖苷酶抑制活性测定结果显示(
图3):在0.03~2 mg/mL浓度范围内,3株菌均表现出良好的抑制活性。同一浓度下,JX和RS的抑制作用最强(
P<0.01),其IC
50分别为35.4 μg/mL和76.6 μg/mL。当浓度达到2 mg/mL时,JX的 α-糖苷酶抑制率达96.55%,与阳性对照药物阿卡波糖的活性水平相当。相比之下,XF的IC
50最高(801.6 μg/mL),表明其抑制活性最弱。
2.4 江西青霉次级代谢物鉴定
基于UPLC-MS/MS技术,结合二级质谱数据与MWDB化合物数据库进行物质鉴定,从江西青霉中成功分析鉴定出197种化合物[
图4(a)、
图4(b)]。其主要成分为:生物碱61种,黄酮类4种,醌类4种,酚酸及衍生物12种,木脂素类7种,萜类67种,甾体4种等[
图4(c)]。江西青霉提取物中检测到主要化合物包括左旋肉碱、
N-阿魏酰酪胺、丁香酸、香豆酸甲酯、原儿茶酸和紫苏子醇等。之前研究报道从江西青霉中检测分离到左旋肉碱
[28]、
N-阿魏酰酪胺等
[29-30],相关活性化合物在本研究检测中均有发现,说明该菌株具有稳定的代谢产物生成能力,且其代谢谱具有一定的保守性。同时,这些已知具有抗氧化或降糖等生物活性的化合物的再次检测,进一步验证了江西青霉在功能性活性物质开发方面的潜力。
2.5 基于网络药理学对江西青霉抗糖尿病作用的预测分析
2.5.1 靶点的获取
基于UPLC-MS/MS技术鉴定的化合物,通过SWISS ADME数据库进行活性成分筛选,获得39个活性成分。对活性成分对应的作用靶点去重后,共得到473个靶点。通过Genecards、TTD、OMIM平台检索并去重后,获得8 722个T2DM相关疾病靶点。
利用微生信系统平台(
https://www.bioinformatics.com.cn/),将473个江西青霉潜在作用靶点与T2DM疾病靶点进行交集分析,绘制韦恩图显示,江西青霉治疗T2DM的潜在作用靶点共416个(
图5)。
2.5.2 PPI网络图构建及通路富集分析
将上述416个共同靶点导入STRING数据库,分析江西青霉治疗T2DM的靶点相互作用关系,采用Cytoscape 3.10.2软件进行网络拓扑分析,筛选出了79个关键靶点并构建PPI网络(
图6)。该网络包含79个节点和1 243条边。基于度值及节点关联强度分析显示,蛋白激酶B1(AKT serine/threonine kinase 1, AKT1)、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor, TNF)、白蛋白(albumin, ALB)、表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor, EGFR)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(Caspase 3, CASP3)、B细胞淋巴瘤2(B-cell CLL/lymphoma 2, BCL2)、雌激素受体1(estrogen receptor 1, ESR1)等蛋白与网络中其他蛋白的连接程度更高,提示其在靶点网络中发挥核心作用的可能性更大。
GO功能富集分析共鉴定出909个生物过程(biological process,BP)、120个细胞组分(cellular component,CC)以及323个分子功能(molecular function,MF)条目[
图7(a)]。其中,BP分类中显著性前十的条目包括:血小板衍生生长因子受体-β信号转导、胰岛素样生长因子受体通路、Eph受体信号系统、表皮生长因子受体通路、胰岛素受体信号途径、血管内皮生长因子受体-1通路、血小板衍生生长因子受体-α 信号转导以及胶原蛋白激活的酪氨酸激酶受体信号转导等。CC分类主要富集于囊泡腔体、胞质囊泡腔及膜微结构域等细胞结构。MF分类显著富集于H3Y41和H2AXY142激酶活性、糖基磷脂酰肌醇锚定的促红细胞生成素受体活性、胰岛素受体活性以及血小板衍生生长因子α受体活性等。使用微生信平台对排名前10的条目以柱状图可视化呈现。
通过KEGG通路富集分析筛选出172条显著通路[
图7(b)]。其中与T2DM密切相关的信号转导途径包括:PI3K-Akt信号系统、EGFR酪氨酸激酶抑制剂耐药途径、HIF-1信号通路、胰岛素抵抗相关通路、AGEs-RAGE信号通路、磷脂酶D信号通路、cAMP信号通路、Ras信号通路、Rap1信号通路等。将排名前25位的条目通过微生信平台可视化后绘制为气泡图。
2.5.3 “药物-成分-疾病-靶点-通路”网络构建
利用Cytoscape 3.10.2构建江西青霉与T2DM的“药物-成分-疾病-靶点-通路”网络图(
图8),结果显示江西青霉治疗T2DM的主要蛋白靶点包括蛋白激酶Cα(protein kinase C alpha, PRKCA)、雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin, MTOR)、碳酸酐酶2(carbonic anhydrase 2, CA2)、EGFR、磷脂酰肌醇-3-激酶催化亚基α(phosphatidylinositol-3-kinase catalytic subunit alpha, PIK3CA)、磷脂酰肌醇-3-激酶催化亚基β(phosphatidylinositol-3-kinase catalytic subunit beta, PIK3CB)、磷脂酰肌醇-3-激酶催化亚基δ(phosphatidylinositol-3-kinase catalytic subunit delta, PIK3CD)、蛋白激酶Bα (protein kinase B alpha, AKT1)、蛋白激酶Bβ (protein kinase B beta, AKT2)、蛋白激酶Bγ (protein kinase B gamma, AKT3)。其中,PI3K-Akt信号通路(hsa04151)、Ras信号通路(hsa04014)和环磷酸腺苷(cAMP)信号通路(hsa04024)是江西青霉干预T2DM的主要信号通路。GO和KEGG分析表明,江西青霉可通过调控氧化应激、糖代谢及脂质代谢相关的分子功能和信号通路,干预T2DM的疾病进展。
2.5.4 分子对接
在2.5.3节的“药物-成分-疾病-靶点-通路”网络构建中,根据拓扑分析按度值较高的4个配体与5个蛋白受体进行分子对接(
图9)。若配体与受体结合时所需的结合自由能越低,则表示其形成的结合构象越稳定。江西青霉4个关键活性成分可与T2DM靶点蛋白自发结合。其中,AKT1与
N-阿魏酰酪胺结合,CASP3与十六碳酰胺结合,TNF与丁香酸结合,EGFR和ALB与Calyxanthone与结合(
表1)。结合能低于-5 kcal/mol,表明稳定结合。其中,丁香酸与TNF蛋白上的氨基酸残基Arg197形成氢键;
N-阿魏酰酪胺与AKT1蛋白上的氨基酸残基Asn54形成氢键;十六碳酰胺与CASP3蛋白上的氨基酸残基Lys195形成氢键,与Gln292形成氢键;Calyxanthone与ALB蛋白上的氨基酸残基Lys199形成氢键,与Arg218形成氢键;Calyxanthone与EGFR蛋白上的氨基酸残基Asp270形成氢键,与Glu288形成氢键。
2.6 葡萄糖消耗量、糖原含量测定结果
(1)葡萄糖消耗量。由
表2所示,与空白对照组相比,模型组细胞的葡萄糖消耗值呈现显著降低的趋势(
P<0.000 1),表明胰岛素抵抗细胞模型构建成功。相较于模型组,不同剂量JX处理组的细胞葡萄糖消耗水平呈现剂量依赖性回升。其中JX-M、JX-H组的葡萄糖消耗值与模型组相比显著升高(
P<0.000 1),而JX-L组与模型组间无显著性差异(
P>0.05)。
(2)糖原含量。由
表3所示,模型组细胞糖原含量较对照组显著降低(
P<0.001)。经不同浓度JX干预后,各给药组糖原含量均有不同程度回升。其中JX-M、JX-H组的糖原含量显著高于模型组(
P<0.05),但JX-L组与模型组比较无显著差异(
P>0.05)。
2.7 蛋白免疫印迹技术检测PI3K、AKT、p-AKT、TNF-α蛋白水平
由
图10的检测结果可知,模型组细胞内PI3K、AKT和p-AKT 3种蛋白的表达水平较正常对照组均呈下调趋势,而TNF-α蛋白的表达水平呈上调趋势(
P< 0.01);经不同浓度JX干预处理后,各给药实验组中PI3K、AKT和p-AKT表达量相较于模型组均出现不同程度的上升,而TNF-α蛋白的表达水平呈下调趋势(
P< 0.01)。
3 讨论
氧化应激是指机体内部活性氧(reactive oxygen species,ROS)生成速率超过抗氧化系统的清除能力,从而引发胰腺
β细胞功能障碍和糖尿病及其并发症发生发展,而抗氧化剂可通过清除自由基有效遏制氧化应激
[31]。虫草类真菌蕴含生物碱、萜类等多种抗氧化活性成分,在慢性病化学预防领域展现出独特优势。已有研究表明,冬虫夏草能减轻糖尿病大鼠的多饮和高血糖症状,同时调节糖尿病患者肝脏和肾脏的抗氧化防御系统,有效缓解组织氧化损伤,为糖尿病多系统并发症的防治提供了新思路
[32]。但当前虫草抗糖研究多聚焦冬虫夏草、蛹虫草等常见物种,大量虫草菌株的生物活性潜力仍待发掘,这为本文研究提供了探索空间。
基于此,首先采用多维度抗氧化评估策略,通过总抗氧化能力测定法、DPPH及ABTS自由基清除实验3种互补性方法,系统评估三株虫草发酵提取物的抗氧化效能。结果显示,江西青霉、枝桠线虫草体外抗氧化活性显著高于雪峰线虫草,且具有浓度依赖性。此外,抑制α-葡萄糖苷酶可通过延缓葡萄糖吸收降低餐后血糖,是T2DM治疗的关键策略
[33],本文研究中α-葡萄糖苷酶的抑制活性最强为江西青霉,枝桠线虫草次之,雪峰线虫草最弱。综合抗氧化与酶抑制活性结果,江西青霉展现出优异的抗T2DM潜力,其活性表现显著优于已报道的部分常见虫草菌株,为虫草降糖药用资源库拓展提供了新的候选菌株。
为进一步解析江西青霉的降糖机制,本文研究创新性建立了“体外活性筛选-UPLC-MS/MS成分鉴定-网络药理学预测”的递进式研究框架:基于UPLC-MS/MS成分表征、化学成分数据及文献综述,从江西青霉中筛选出39种有效活性成分;通过靶点预测与T2DM疾病靶点映射,获得416个相关潜在靶点,最终筛选出79个关键靶点。PPI网络分析显示,AKT1、TNF、CASP3、ALB、EGFR、BCL2、ESR1是江西青霉治疗T2DM的潜在关键靶点。其中,AKT1作为PI3K-AKT信号通路核心激酶,不仅在胰岛素介导的葡萄糖代谢中起关键作用,同时,还对胰岛β细胞的存活和增殖具有积极作用
[17]。其次,TNF与T2DM关联密切,TNF-α在糖尿病的发病机制中占据重要地位,凭借其促炎特性,干扰胰岛素信号传导,从而产生胰岛素抵抗
[34],是糖尿病发生发展的关键影响因素。
“药物-成分-疾病-靶点-通路”网络分析进一步揭示,江西青霉治疗T2DM的靶点主要富集于PI3K-Akt信号通路(hsa04151)、Ras信号通路(hsa04014)和cAMP信号通路(hsa04024)。其中,PI3K-Akt信号通路与T2DM病理机制密切相关。该通路不仅参与细胞动员、迁移、分化及抗凋亡过程,还通过调控葡萄糖转运、糖原合成、糖酵解、糖异生、蛋白质合成和脂肪分解等代谢环节影响血糖稳态
[35]。Ras信号通路与胰岛素抵抗存在显著的调节关联和功能相互作用。它参与胰岛素信号转导,影响胰岛β细胞功能与葡萄糖代谢,并且在糖尿病并发症的发生发展进程中起到推动作用,是调控血糖水平和疾病进展的关键环节之一
[36]。基于上述通路与疾病的关联机制,分子对接结果进一步表明,丁香酸、
N-阿魏酰酪胺、十六碳酰胺、Calyxanthone这几个核心活性成分与TNF、AKT1、CASP3、ALB、EGFR这几个靶点均具有良好的结合活性。阐明了此类成分在江西青霉发挥降糖活性过程中的核心地位,为天然产物活性成分的靶向筛选与开发提供了新思路。
上述机制预测结果经IR-HeGp2细胞实验验证:江西青霉可显著提升细胞葡萄糖消耗量及糖原含量(中、高剂量组P<0.05至P<0.000 1),有效改善胰岛素抵抗;蛋白免疫印迹技术检测出了江西青霉给药组PI3K、AKT、p-AKT蛋白表达水平上调,TNF蛋白表达水平下调。提示江西青霉可能通过靶向PI3K-Akt、Ras等通路关键蛋白干预T2DM的分子机制。至此,前述递进式框架进一步形成“体外活性筛选-UPLC-MS/MS成分鉴定-网络药理学预测-细胞实验验证”的全链条研究范式,实现从活性发现到机制确证的完整闭环,大幅提升了结论的科学性与可靠性。
4 结论
通过物种应用创新、技术范式创新及成分靶点协同创新,证实江西青霉具备优异的抗T2DM潜力且呈多分子、多靶点的作用特点,为虫草真菌资源在糖尿病防治领域的深度开发提供了更系统可靠的科学参考,也为新型天然降糖药物的研发奠定了理论与实验基础。
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