据统计,中国心血管疾病(cardiovascular diseases,CVD)患病人数约有3.3亿,CVD的患病率和死亡率均位居全国首位
[1],给中国社会经济带来了沉重的负担,已成为重大的公共卫生问题,因此,CVD防治刻不容缓。动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)是CVD的主要病理基础之一
[2],有效防治AS对于CVD的治疗至关重要。目前,他汀类药物作为治疗AS的一线药物,虽然其疗效确切,但却容易出现肝损害,横纹肌溶解等副作用
[3-4]。中药具有多种组分、多种单体,可通过多途径作用于疾病的不同靶点。这种特性使得中医药在治疗疾病时能够发挥整体调节作用,这与现代医学的单一靶点药物形成鲜明对比
[5],因此,深入挖掘中医药宝库,并致力于开发有效防治AS的中药新药意义重大。
AS的发病机制十分复杂,其发病涉及血脂代谢紊乱、氧化应激、炎症反应、内皮细胞功能障碍、线粒体功能障碍、铁死亡等多个方面
[6-7]。中医学认为,痰浊是AS的主要致病因素,AS的治疗可从谈论治
[8]。温胆汤是治痰的经典名方,目前广泛应用于AS的治疗当中,然其作用机制尚未阐述清楚。基于此,运用网络药理学研究方法预测温胆汤治疗AS的关键靶点及作用机制,并通过实验研究进行初步验证,以期为温胆汤的临床应用提供科学依据。
1 网络药理学研究方法
1.1 温胆汤中药活性成分-靶点的搜集
首先将温胆汤中药组成中的半夏、陈皮、枳实、茯苓、甘草中药名输入TCMSP平台(
http://lsp,nwu.edu.cn/tcmsp.php)中进行检索,得到符合标准的中药化学成分,并根据中药有效成分收集其作用的相关靶点。利用UniProt(
http://www.uniprot.org/)数据库匹配靶点基因名,并对其进行注释。通过SYMmap数据库(
http://www.symmap.org/)搜集竹茹的有效化合成分;运用PubChem数据库(
https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)获得其有效成分,并在数据库SwissTargetPrediction(
http://www. swisstargetprediction.ch)预测其有效靶点。将所有温胆汤中药化合物与其对应的靶点收集,建立温胆汤化合物-靶点数据库。
1.2 AS疾病靶点的预测
以动脉粥样硬化“Atherosclerosis”为关键词,在数据库GeneCard和OMIM中进行检索,分别从两个数据库中得到AS的疾病靶点,合并后得到AS疾病相关靶点。
1.3 温胆汤与AS的共同靶点
将温胆汤有效化合物的靶点和AS的疾病相关靶点导入软件Venny(
https://bioinfogp.cnb.csic.es/ tools/venny/)中,最后通过软件分析得到温胆汤与AS的共同靶点。
1.4 “温胆汤成分-靶点-AS疾病”网络分析
准备温胆汤中药化合物基因“network”文件和靶点Type文件,运用Cytoscape3.9.2软件,导入相关文件,进行网络拓扑学分析,构造“温胆汤成分-靶点-AS疾病”网络图。
1.5 蛋白互作(PPI)网络构建及网络拓扑分析
通过韦恩图获得温胆汤和AS两者的共同靶点基因后,将其导入String网络平台,设置相关筛选参数,得到蛋白互作关系。结果导入Cytoscape3.9.2软件中,并对网络进行分析,保存网络分析结果,挑选核心的靶点做出蛋白相互作用网络图。根据Degree值大小筛选核心靶点。
1.6 GO和KEGG富集分析
利用生物信息学开源软件 Bioconductor(
http://www.bioconductor.org/)在R软件进行生物学过程的GO 、KEGG功能富集分析,并通过气泡图方式进行展示。
2 实验材料与方法
2.1 动物
8周龄的SPF级雄性载脂蛋白E基因敲除(ApoE-/-)小鼠50只和C57BL/6J小鼠10只,体重20~22 g。动物由江苏集萃药康生物科技股份有限公司提供,许可证号:SCXK(苏)2023-0009。本课题动物饲养在江西中医药大学实验动物科技中心SPF级动物房,动物伦理批号:20230510001。
2.2 药物与试剂
(1)药物。全方由半夏10 g、陈皮15 g、枳实 10 g、竹茹10 g 、茯苓10 g、甘草5 g组成,所有药材从江西中医药大学附属医院中药房购买。以10倍体积去离子水浸泡1 h,武火煮沸,文火煮0.5 h,取药汁、过滤,将2次药液合并,浓缩至所需给药质量浓度。温胆汤给药质量浓度分别为390、780、1 560 mg/mL,按照小鼠体质量予0.1 mL/10 g剂量灌胃。阿托伐他汀钙片购于江西中医药大学附属医院药房(立普妥,辉瑞制药有限公司,国药准字:H20051409,规格20 mg/片)。
(2)试剂。小鼠SOD试剂盒(货号:ADS-F-KY011,江苏酶免生物科技股份有限公司)、小鼠MDA试剂盒(货号:ADS-F-YH002,江苏酶免生物科技股份有限公司),小鼠GSH含量检测试剂盒(货号:ADS-F-G001,江苏酶免生物科技股份有限公司),BCA蛋白浓度测定试剂盒(货号:P0012,碧云天生物技术有限公司),小鼠p53、SLC7A11、GPX4抗体(货号分别为10442-1-AP、26864-1-AP、67763-1-Ig,武汉三鹰生物技术有限公司)。
2.3 实验方法
2.3.1 分组造模及干预
10只C57BL/6J小鼠为正常组,给予普通饲料喂养12周。50只8周龄的雄性ApoE-/-小鼠按照随机数字表法随机均分为5组:AS模型组,低剂量温胆汤组,中剂量温胆汤组,高剂量温胆汤组,立普妥组。采用高脂饲料(脂肪含量21%,胆固醇0.15%,蛋白质15.5%)喂养12周建立ApoE-/-小鼠AS模型。第9周开始,温胆汤低、中、高剂量组小鼠分别给予3.9、7.8、15.6 g/kg温胆汤中药灌胃,立普妥组给予阿托伐他汀钙片2.6 mg/(kg/d)灌胃,空白组和模型组给予等量0.9%氯化钠注射液灌胃,连续予中药汤剂干预4周,于末次给药2 h后收集小鼠血清和血管组织,将其保存好,待检测。
2.3.2 主动脉组织形态学检测
采用HE染色法观察各组小鼠主动脉组织形态学变化。
2.3.3 小鼠血脂水平检测
采用全自动生化分析仪检测小鼠血浆中总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)水平。
2.3.4 血清SOD、MDA、GSH水平检测
采用Elisa法检测各组小鼠血清超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)、谷胱甘肽(glutathione,GSH)水平,严格按照试剂盒说明书进行操作。
2.3.5 RT-PCR检测主动脉p53、SLC7A11、GPX4 mRNA表达水平
从-80 ℃冰箱中将小鼠主动脉血管组织取出解冻,采用Trizol法提取总RNA,用核酸测量仪,测量RNA纯度和浓度。将RNA逆转录为cDNA,采用实时荧光定量PCR法加入扩增反应体系,PCR反应程序如下:Stage1:95 ℃ 30 s;Stage 2:95 ℃ 5 s,60 ℃ 30 s,39个循环;Stage 3:95 ℃ 10 s,65 ℃ 5 s,95 ℃ 15 s。检测相关基因mRNA相对表达水平。以2
-ΔΔCT相对定量法来计算,其中ΔΔCT=(CT
目的-CT
内参)
处理组-(CT
目的-CT
内参)
对照组。引物由擎科生物有限公司合成,序列如
表1所示。
2.3.6 Western blot法检测主动脉p53、SLC7A11、GPX4蛋白表达
采用蛋白质免疫印迹法(Western blot)检测各组小鼠主动脉组织中p53、SLC7A11、GPX4的蛋白表达,将组织按BCA法提取并测定蛋白浓度,进行蛋白变性,进行SDS-PAGE电泳,经过转膜,封闭,一抗孵育,二抗孵育,洗膜,显影,拍照,最后通过Image J 软件定量分析p53、SLC7A11、GPX4等条带的灰度值。
2.4 统计学方法
实验数据均为计量资料数据,符合正态分布采用均数±标准差($\stackrel{-}{x}$±s)表示,SPSS 22.0软件进行统计分析,组间比较首先进行方差齐性检验,若方差齐,组间比较采用LSD法检验,若方差不齐,组间比较采用Tamhane法检验,两两比较采用t检验,以P<0.05为差异有统计学意义。
3 结果
3.1 网络药理学结果
3.1.1 温胆汤中药化合物的筛选
通过在数据库平台检索,最后建立温胆汤化合物-靶点数据库,共获得温胆汤化学成分38个,如
表2所示,根据口服生物利用度(oral bioavailability,OB)值(列举前10个),其中,半夏13个、陈皮5个、茯苓6个、甘草92个、枳实22个、竹茹3个,预测靶点共298个。
3.1.2 建立AS疾病靶点数据库
AS疾病靶点数据库建立在GeneCards、OMIM数据库中进行检索,分别得到两个数据库靶点,合并后剔除重复基因,得到AS疾病相关靶点4 920个。
3.1.3 温胆汤与AS交集靶点筛选
通过韦恩图形式获取温胆汤中药活性成分和AS两者之间共同的靶点有235个,如
图1所示。其中235个基因对应化合物有26个,如
图2所示。
图2中紫色三角形代表温胆汤,绿色锥形代表AS,六边形节点代表化合物,菱形节点代表基因靶点,一个节点的自由度表示网络中和节点相连接的线条数目。通过分析得知,温胆汤治疗AS的核心化合物成分有槲皮素、黄芩素、木犀草素、柚皮素、川陈皮素。核心化合物成分的Degree值如
表3所示。
3.1.4 PPI网络的构建
将235个共同靶点导入SRTING中,将结果以文本形式导出, 然后导入Cytoscape3.9.2软件中,如
图3所示,根据Degree大小进行分析,Degree排名前10的靶点如
表4所示。
3.1.5 温胆汤-AS-基因的生物学过程
根据显著性程度
P<0.05(
P由小到大)进行部分展示,GO分析结果(
图4)表明,温胆汤治疗AS基因靶点的生物过程 (biological process,BP) 显著富集在对氧化应激、脂多糖、活性氧、类固醇激素、缺氧的反应,对平滑肌细胞增殖、炎症反应、脂质代谢的调控等。分子功能主要富集在核受体活性、配体激活的转录因子活性、RNA聚合酶II特异性DNA结合转录因子结合、DNA结合转录因子结合、类固醇激素受体活性、细胞因子受体结合等;细胞组分(cellular component,CC) 主要富集在细胞膜微区、膜区域、蛋白激酶复合体、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶复合体、线粒体外膜、细胞膜外侧等。
3.1.6 温胆汤-AS-基因的生物学通路
KEGG富集分析得到通路242条,根据
P<0.05得到排名前20的信号通路,如
图5所示,主要有:脂质代谢与动脉粥样硬化、炎症相关信号通路、缺氧诱导因子-1信号通路、磷脂酰肌醇3激酶-蛋白激酶B信号通路、细胞凋亡、化学致癌-活性氧、非酒精性脂肪性肝病、细胞衰老、T细胞受体信号通路、甲状腺激素信号通路、酒精性肝病、Toll样受体信号通路、p53信号通路、FoxO信号通路、MAPK信号通路、胰岛素抵抗、脂联素信号通路等。分析结果表明,温胆汤可能通过作用于这些通路起到防治AS的作用。
3.2 实验结果
3.2.1 各组小鼠主动脉组织病理形态学变化
如
图6所示,正常组小鼠主动脉血管内皮内膜完整,无增生,中膜平滑肌和弹性纤维形态排列较规则;模型组小鼠主动脉血管内中膜明显增厚,有脂质斑块形成,斑块中的细胞结构排列紊乱;与模型组相比较,温胆汤低、中、高剂量组主动脉血管内斑块均减小,但温胆汤高剂量组斑块减小更为显著;立普妥药物治疗组可见少量动脉斑块。
3.2.2 温胆汤对各组小鼠血脂的影响
如
图7所示,与空白组相比,模型组TC、TG、LDL-C水平增加(
P<0.01,
P<0.01,
P<0.01),模型组HDL-C水平显著下降(
P<0.01);与模型组相比,温胆汤中高剂量组及立普妥组TC、TG、LDL-C水平明显降低(
P<0.01,
P<0.01,
P<0.01),其中温胆汤各组呈现浓度依赖性,高剂量疗效优于低中剂量(
P<0.01),立普妥组较温胆汤各组降低TC水平更为显著(
P<0.01)。
3.2.3 温胆汤对各组小鼠血清SOD、MDA、GSH的影响
如
图8所示,AS模型组的血清SOD、GSH水平较空白组显著降低(
P<0.01、
P<0.01),MDA水平则较空白组显著提高(
P<0.01);与AS模型组比,中、高剂量温胆汤组的抗氧化应激指标SOD、GSH水平有较为明显升高(
P<0.05、
P<0.01),其中高剂量温胆汤组,升高更明显;而MDA水平则完全相反,中、高剂量温胆汤组的MDA水平较模型组明显下降(
P<0.05、
P<0.01),其中高剂量组疗效更显著。
3.2.4 温胆汤对p53、SLC7A11、GPX4蛋白表达的影响
如
图9所示,AS模型组与空白组比,模型组小鼠主动脉血管组织中的p53蛋白表达水平下降(
P<0.01),而模型组中的SLC7A11、GPX4的蛋白表达水平则下降显著(
P<0.01、
P<0.01)。与模型组比,低剂量温胆汤组的p53、SLC7A11、GPX4蛋白表达水平没有显著差异(
P>0.05、
P>0.05、
P>0.05),中、高剂量温胆汤组中p53蛋白表达水平则显著升高(
P<0.01、
P<0.01),SLC7A11、GPX4的蛋白表达量则明显增加(
P<0.01、
P<0.01),其中高剂量温胆汤组差异最显著。
3.2.5 温胆汤对p53、SLC7A11、GPX4 mRNA表达的影响
如
图10所示,与空白对照组比,模型组血管组织中
p53的mRNA相对表达量有明显上升(
P<0.01),
SLC7A11、
GPX4的mRNA相对表达量则下降(
P<0.01、
P<0.01)。与模型组比较,中、高剂量温胆汤组小鼠主动脉
p53 mRNA相对表达量较明显下降(
P<0.01,
P<0.01),
SLC7A11、
GPX4表达水平显著升高(
P<0.01,
P<0.01),而低剂量温胆汤组中的
p53、
SLC7A11、
GPX4的mRNA相对表达量与模型组比,则无显著差异(
P>0.05,
P>0.05,
P>0.05)。
4 讨论
中医学中并无“动脉粥样硬化”之称,但中医病证之“胸痹”“中风”均与其密切相关。目前多数中医均认为AS的病理变化主要表现为本虚标实,虚实夹杂。本虚包括脏腑、气血阴阳虚衰,而标实主要有血瘀、痰浊、寒凝、湿热等
[9]。其中,痰浊是AS的重要致病因素。痰湿是胸痹的重要致病因素,治疗时十分重视从痰湿入手
[10-11]。痰浊和瘀血是胸痹的重要病机,并指出痰瘀相互影响,痰是瘀的早期阶段,瘀是痰的进一步发展。因此提出痰瘀同治,并以痰为主的治疗理念
[12]。现代医学认为脂质代谢异常是AS病变的基础,而诸多医家认为高血脂是“血中之痰浊”“腑中之痰浊”
[13]。由此可见,AS与痰密切相关,AS可从痰论治。温胆汤是化痰的经典名方,具有理气化痰的功效,温胆汤及其类方广泛运用于心血管疾病的临床治疗,取得良好疗效
[14-16]。现代许多研究也发现温胆汤具有抗AS的作用
[17-18],然其机制并不十分清楚。本研究旨在探讨温胆汤抗AS的可能机制。
通过网络药理学分析可知,温胆汤治疗 AS 的有效活性成分有38个,其中关键成分有槲皮素、黄芩素、木犀草素、柚皮素、川陈皮素等,现代药理学研究表明,这些成分具有很好抗氧化,抗炎、调节血脂代谢等抗AS作用
[19-20]。通过对PPI分析发现,P53、JUN、AKT1、STAT3、IL6可能是温胆汤治疗AS的关键靶点。其中P53是自由度最高的靶点,这表明P53可能是温胆汤治疗AS中的核心靶点。P53是一种肿瘤抑制蛋白,在细胞凋亡、基因组稳定性和代谢调节方面发挥重要作用,与AS的发生发展密切相关,并影响AS斑块的稳定性。研究表明,在ApoE
-/-小鼠模型中,P53的全身性缺失加速了AS斑块的形成
[21]。P53与氧化应激密切相关,P53在氧化应激条件下被激活,进而调节细胞的抗氧化反应。KEGG结果也表明,温胆汤可通过P53信号通路发挥抗AS的作用。
p53通路还与铁死亡密切相关,在铁死亡的调节中起着核心作用
[22]。铁死亡是一种新兴的细胞死亡方式,其通过多种机制参与AS的发生和进展。铁过载促进Fenton反应产生活性氧(reactive oxygen species,ROS),加速脂质过氧化
[23],从而促进AS的形成和发展。p53通过抑制SLC7A11的蛋白水平来增强细胞铁死亡。SLC7A11是System x-(抗氧化体系)的亚基,负责主要的转运活性,SLC7A11被抑制会影响胱氨酸的吸收,进而影响GSH的合成,导致膜脂修复酶GPX4活性降低,降低细胞抗氧化能力,从而促进铁死亡
[24]。GPX4作为铁死亡的重要调节蛋白,其通过保护细胞免受氧化损伤,控制细胞氧化还原状态的平衡。GPX4敲除会促进脂质过氧化并诱导细胞毒性,加重动脉粥样硬化程度,而GPX4过表达可缓解ApoE
-/-小鼠主动脉窦和主动脉树动脉粥样硬化病变
[25]。
为进一步验证温胆汤能否通过P53信号通路发挥抗AS作用,课题组通过实验加以验证。研究结果显示,与正常组相比,AS模型组小鼠中主动脉血管内膜明显增厚,形成粥样斑块,且TC、TG、LDL-C水平显著升高,血清SOD和GSH水平增加,MDA水平下降,这说明AS小鼠血脂水平升高,脂代谢发生紊乱,氧化应激反应增加。经过药物干预后,温胆汤低、中、高治疗组均能够延缓斑块的进展,降低血脂,改善氧化应激水平,其中高剂量组疗效更加显著。通过对p53/SLC7A11通路相关因子检测发现,温胆汤能够抑制p53蛋白和mRNA表达,同时增加SLC7A11、GPX4的蛋白和mRNA水平,这说明温胆汤抗AS的机制可能与调控p53/SALC7A11通路相关。
5 结论
网络药理学及实验研究表明温胆汤能够调节血脂代谢、抗氧化应激治疗AS,其作用机制之一可能与温胆汤通过作用于核心靶点P53,并调控p53/SLC7A11信号通路,抑制铁死亡相关。
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