微生物燃料电池(microbial fuel cell, MFC)是一种可将有机物直接转化为电能的新型技术,在污染治理与可再生能源领域备受关注。MFC的核心是具备胞外电子传递(extracellular electron transfer, EET)能力的电活性生物膜(electroactive biofilm, EAB)
[1]。EAB不仅决定了MFC对污染物的去除效率,也直接影响系统的稳定性和长期运行性能
[2]。然而,在实际水环境中,MFC常面临各类抗生素的胁迫,其中磺胺类抗生素因其水溶性强、持久性高,对EAB功能构成潜在威胁。
磺胺甲嘧啶(sulfadiazine, SDZ)作为一种广泛应用于畜牧医疗的广谱抗生素,因其强抗菌性及在自然环境中频繁检出,已被列为“高优先级”磺胺类药物
[3]。现有关于SDZ对MFC影响的研究主要集中在其高浓度(>5 mg/L)的抑制效应上。例如,Zhao等
[4]报道了高浓度SDZ对阳极微生物群落多样性的显著抑制作用;汪素芳等
[5]则观察到SDZ在MFC中的降解行为。然而,这些研究均未系统揭示SDZ在低浓度下的生态效应,特别是其对EAB功能可能存在的促进潜力尚未被认知。
值得注意的是,其他类别抗生素(如四环素、妥布霉素)的研究表明,低剂量暴露可能会激活微生物应激响应而增强其代谢活性
[6-7],但在SDZ-MFC体系中,这种浓度依赖性规律及其对电子传递路径的影响机制仍属未知。特别是在分子水平上,SDZ是否会对电子传递链关键酶产生特异性结合,进而影响EAB的电化学活性,目前尚未见报道。这种机制认识的缺失,限制了对SDZ环境效应的准确评估及MFC在含抗生素废水中应用的优化。
综上所述,当前研究对SDZ在MFC系统中“低浓度促进效应”的认知存在明显空白,对其分子水平的作用靶点更是缺乏探索。现通过系统考察不同浓度SDZ(0、0.5、10 mg/L)对MFC产电性能、EAB结构与功能的影响,重点揭示:①SDZ是否存在低浓度促进、高浓度抑制的双重效应;②该效应如何通过电子传递途径(直接/间接电子传递)的转变实现;③SDZ与电子传递链关键酶的分子相互作用机制。研究成果可为准确评估其环境风险及优化MFC运行提供新见解。
1 材料与方法
1.1 MFC反应器的构建与运行
采用单室MFC反应器,阳极选用碳纤维刷(直径3 cm,长3 cm),阴极为表面负载0.5 mg/cm
2铂的碳布(有效面积为7 cm
2)
[8],电极间距为1 cm。阴阳极通过钛丝连接至外电阻(1 000 Ω)。所有反应器在(30±1) ℃恒温运行。
启动阶段,MFC的进水为生活污水与人工配水按1∶1的体积混合,人工配水的组成包括1.0 g/L乙酸钠、50 mmol/L磷酸盐缓冲溶液、12.5 mL/L微量元素和5 mL/L维生素溶液。使用生活污水旨在利用其复杂的微生物群落促进EAB的快速形成。实验设三组MFC,每组3个平行,分别添加0、0.5、10 mg/L的SDZ。该浓度设置旨在模拟不同的环境暴露场景:0.5 mg/L代表常见的磺胺类药物环境残留浓度,用于考察低剂量环境暴露对MFC的潜在影响;10 mg/L则模拟制药或养殖废水等高污染情境,用于研究高浓度胁迫的抑制效应。通过与空白对照组(0 mg/L)对比,旨在揭示SDZ对阳极生物膜的双重(促进/抑制)剂量效应,更详细的剂量效应关系会在后续研究中重点关注。当输出电压降至50 mV以下时更换进水,连续三个周期的输出电压稳定视为启动完成。启动完成后,为控制实验变量、减少生活污水中复杂有机物及未知组分对SDZ效应的干扰,仅使用人工配水作为MFC进水。
1.2 电化学测试方法
使用PISO-813系统实时记录外电阻两端电压。为评估SDZ对阳极生物膜电化学性能的影响,采用循环伏安法(cyclic voltammetry,CV)和电化学阻抗谱(electrochemical impedance spectroscopy,EIS)进行测试。电化学测试采用三电极体系
[9]:工作电极为阳极,对电极为铂片,参比电极为甘汞电极。CV扫描范围为-0.8~0.5 V,扫速为1、3、5、10 mV/s,该扫速范围选择基于常用于研究EAB电子传递机制的扫描范围,旨在覆盖扩散控制与动力学控制的不同区域,以精准解析电子转移动力学特征
[10]。每个扫速下均进行3次重复测试,取第3次稳定周期的数据用于分析,以确保结果的准确性和可靠性。EIS测试频率为10 Hz~100 kHz,振幅10 mV。为量化直接与间接电子传递的贡献,采用多扫速CV数据拟合分解模型进行分析,该方法已广泛应用于EAB研究
[11]。
1.3 EAB形貌与结构分析方法
运行结束后,取阳极生物膜预处理后进行扫描电子显微镜观察
[12]。利用加热-离心法对胞外聚合物(extracellular polymeric substances, EPS)进行分级提取
[13],包括可溶性EPS(S-EPS)、松散结合EPS(LB-EPS)和紧密结合EPS(TB-EPS),通过F-7000荧光分光光度计获取三维荧光光谱。测试参数为:激发波长200~400 nm,发射波长280~550 nm,狭缝宽度5 nm,扫描速度为1 200 nm/min
[14]。
1.4 微生物群落结构分析方法
运行结束后,采集各反应器阳极生物膜样本并进行DNA提取。靶向扩增16S rRNA基因的V3-V4可变区,引物为338F和806R
[15]。扩增后的聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)产物经质量检测和纯化后,进行高通量测序。序列数据通过Majorbio-I-Sanger云平台进行处理,包括序列质量控制、物种注释和多样性分析。选取高丰度操作分类单元(operational taxonomic unit,OTU)进行Spearman相关性分析,筛选|
r|>0.8且
P<0.01的关系构建共现性网络
[16]。
1.5 分子模拟分析方法
采用(molecular operating environment,MOE)软件分析SDZ与电子传递链关键蛋白间的氢键、疏水及静电作用,识别关键氨基酸残基,评估SDZ对酶结构及功能的影响。
2 结果与讨论
2.1 不同浓度SDZ对MFC电化学性能的影响
首先,对添加不同浓度SDZ的MFC输出电流密度进行监测[
图1(a)]。添加0.5 mg/L SDZ的MFC(MFC-0.5)最大电流密度为(17.83±0.06) A/m
3,显著高于未添加组[MFC-0,(14.44±0.43) A/m
3]和10 mg/L组[MFC-10,(8.85±0.13) A/m
3]。CV测试进一步揭示了不同浓度SDZ对EAB电化学活性的调控作用[
图2(b)]。CV曲线的封闭面积反映了电极界面的氧化还原活性和电子转移速率
[17]。MFC-0.5的CV曲线呈现最大封闭面积,而MFC-10的则显著缩小,表明高浓度SDZ抑制了生物膜的代谢及电子传递能力。通过EIS[
图1(c),
表1]分析发现,MFC-0.5的总内阻最低(9.33 Ω),显著低于MFC-0(28.16 Ω)和MFC-10(55.76 Ω)。
上述结果表明SDZ对EAB的剂量依赖性调控作用。低浓度SDZ表现出的促进作用可能与其诱导了微生物群落的轻度胁迫响应有关。文献[
18]表明,30 μM的甲氧苄啶可刺激微生物电子传递相关通路的激活与关键酶活性的提升,进而优化胞内电子的转移效率及对电极的传递过程。相反,高浓度SDZ(10 mg/L)的抑制效应可能是引起了微生物细胞膜结构损伤和细胞通透性增加,导致细胞内电子传递途径受阻。此外,高浓度SDZ还可能通过抑制关键电活性菌株的增殖和活性,降低活性菌群的多样性及丰度
[19]。
2.2 不同浓度SDZ对EAB电子传递机制的影响
通过分析不同扫描速率(1~10 mV/s)下的CV曲线,研究了EAB的电子传递机制,结果如
图2所示。当峰电流与扫描速率的平方根(
v1/2)呈线性关系时,电子传递以扩散控制为主,依赖于溶液中电子中介体的扩散过程,即间接电子传递(mediated electron transfer,MET);而峰电流与扫描速率
v呈线性关系时,则表明电子传递过程以动力学控制为主导,即直接电子传递(direct electron transfer,DET)
[20]。在无SDZ条件下(MFC-0),峰电流与
v1/2呈线性(
R2=0.84),反映出扩散控制机制占主导,表明生物膜更多依赖于间接电子传递。同时,DET贡献比例随扫速升高从29%(1 mV/s)增至56%(10 mV/s),表明高扫速下,界面电子转移动力学速率增强,促进了DET路径的贡献比例。在添加0.5 mg/L SDZ条件下(MFC-0.5),峰电流与
v高度线性相关(
R2=0.98),说明电子传递机制转变为DET为主导。在扫速为10 mV/s时,DET贡献比例为83%,表明低浓度SDZ优化了阳极生物膜界面微环境,增强了DET路径
[17]。而在10 mg/L SDZ条件下(MFC-10),峰电流显著降低,且与
v1/2线性相关(
R2=0.97),表明电子传递机制回归以MET为主。DET贡献比例大幅降低(1 mV/s时为6%,10 mV/s时为24%),说明高浓度SDZ严重抑制了生物膜界面直接电子交换能力。
2.3 不同浓度SDZ对胞外聚合物的影响
通过三维荧光光谱分析了不同浓度SDZ对EPS组分的影响,结果如
图3所示。对于MFC-0的阳极生物膜,其S-EPS、LB-EPS与TB-EPS的荧光谱图均呈现出典型的蛋白质类荧光特征(激发波长230~250 nm,发射波长300~350 nm)
[21]。MFC-0.5阳极生物膜的三种EPS组分的荧光强度均显著提升,特别是在270~290 nm激发波长区域出现新的荧光峰,证实了芳香族氨基酸及类色氨酸蛋白质等组分的明显积累
[22],这些组分被认为与EPS的电子传递能力相关。这表明低剂量SDZ可能诱导微生物选择性合成更丰富的结构蛋白,从而增强EPS网络的电子传递连续性,这与EIS分析结果高度一致,这为低浓度SDZ能够强化阳极生物膜的电子传递能力提供了关键的电化学证据。然而,EPS导电性能的直接验证需要后续研究进一步确认。而在高浓度SDZ(10 mg/L)胁迫下,三类EPS组分的荧光强度明显下降,主荧光峰明显衰减且范围变窄。这可能由于高浓度SDZ直接损伤细胞活性,抑制了EPS合成与分泌,削弱了生物膜的胞外电子传递能力及其对环境胁迫的适应与修复能力。
2.4 不同浓度SDZ对EAB微观形貌的影响
为系统观察不同浓度SDZ对阳极生物膜微观结构的调控作用,采用扫描电子显微镜对其形貌与附着情况进行表征。在无SDZ的对照组(MFC-0)中,阳极表面形成的生物膜结构松散且不连续,微生物细胞附着密度低,电极表面可见大量明显的孔洞和裸露区域,如
图4(a)所示。这种疏松结构可能限制了微生物与电极之间电子传递的有效接触面积,降低直接电子传递效率。在0.5 mg/L SDZ条件下,阳极表面形成了一层更为致密且均匀的生物膜,如
图4(b)所示,这种紧密结构可能优化了微生物-电极界面的电子传递通道,显著增强了导电微生物的附着,提高了直接电子传递途径的贡献。而在高浓度SDZ(MFC-10)条件下,阳极生物膜的结构受到严重破坏,表现为微生物附着密度显著降低,电极表面暴露区域明显增加,结构整体不规则且不连续,如
图4(c)所示。此外,高浓度SDZ还可能直接抑制了关键电活性微生物的增殖及功能,导致生物膜的电子传递效率明显下降
[19]。
2.5 不同浓度SDZ对EAB群落结构的影响
微生物群落结构分析[
图5(a)]表明,低浓度SDZ(0.5 mg/L)显著提高了电活性微生物(如
unclassified_f_Comamonadaceae)的相对丰度。
Comamonadaceae科是一类与电子传递密切相关的功能菌群
[23],其丰度增加有利于提升MFC的电化学性能。这种正向效应可能源于低浓度的SDZ调节了微生物群落内部竞争与互作关系,形成了适于电活性微生物生长的生态位。然而,当SDZ浓度升至10 mg/L时,另一类重要电活性微生物
Hyphomicrobium属的丰度显著下降。这表明高浓度SDZ对
Hyphomicrobium产生了明显抑制作用。高浓度SDZ可能通过损伤细胞膜结构、破坏膜的通透性及抑制细胞内关键酶系,严重影响了
Hyphomicrobium的代谢活性和电子传递功能
[24]。此外,高浓度SDZ可能还扰乱了微生物的能量代谢通路,降低了
Hyphomicrobium的竞争能力,导致其在生物膜中的存活率降低。
通过构建微生物共现性网络[
图5(b),
表2]深入揭示了EAB中群落结构的复杂性及其内在生态互作机制。网络呈现出明显的模块化特征(指数为0.688),反映微生物群落在生态功能上的显著分工,不同模块内的微生物可能分别承担电子传递、底物降解和营养物质循环等特定生态功能。此外,网络平均聚集系数为0.65,表明微生物在局部区域具有密集的相互作用,这种局部紧密联结的特征可能提升了群落应对环境扰动时的功能稳定性,并加强了物质与信息的快速传递。同时,网络的平均度(12.98)与图密度(0.065)较高,表明整体网络具有良好的连通性,有利于群落内微生物功能的协同与协调。网络的平均路径长度为4.7进一步显示出群落中微生物之间的高效传递路径,暗示存在若干核心微生物节点在群落功能维持及电子传递过程中发挥关键的生态主导作用。综上所述,该共现性网络展示了微生物群落间的高度协同作用和生态适应性,为进一步研究微生物群落在不同环境条件下的功能调控机制提供了理论支撑。
2.6 SDZ对电子传递链关键酶的作用机制分析
胞内电子传递链(electron transport chain,ETC)是微生物能量代谢的核心,其中关键酶的活性直接关系到电子传递效率。SDZ可能通过与这些酶的特异性结合干扰其生理功能。采用分子对接方法,在分子水平上分析SDZ与ETC关键酶之间的相互作用,并结合宏基因组学数据,评估了SDZ暴露对相应编码基因丰度的影响,如
图6所示。在分子对接中,静电力是衡量配体与蛋白相互作用的重要参数, 数值越负,表明结合亲和力越强
[25]。分子对接结果如
表3所示,SDZ与复合物I(NADH脱氢酶)的结合能较低(-2.93 kJ/mol),表明二者之间的相互作用较弱。基因丰度分析也验证了这一趋势,在不同SDZ浓度下,复合物I相关基因的丰度变化极小,几乎保持稳定。对于复合物II(琥珀酸脱氢酶)和复合物III(细胞色素bc1复合物),分子模拟未观察到其与SDZ的结合,表明SDZ对这两种复合物的影响较小。相比之下,SDZ与复合物IV(细胞色素c氧化酶)表现出最强的相互作用(-183.58 kJ/mol),表明SDZ能显著干扰该酶的结构与活性。基因丰度数据也反映出这一效应,SDZ存在时复合物IV基因丰度显著降低,且降幅最大,说明复合物IV可能是SDZ影响ETC功能的重要靶点。此外,SDZ与复合物V(ATP合酶)的结合能为-14.65 kJ/mol,表明SDZ对该酶也有一定的影响。这表明SDZ对ETC酶的抑制作用存在明显的靶向选择性,尤其以复合物IV最为显著。综上所述,SDZ主要通过影响复合物IV活性而显著干扰微生物胞内电子传递链的效率,而对其他酶复合物的作用相对较弱或可忽略。这一结果为理解SDZ对EAB电子传递链的选择性作用提供了重要证据,是本研究的创新点之一。
3 结论
向单室MFC中添加不同浓度的SDZ(0、0.5、10 mg/L),得到以下结论。
(1)低浓度SDZ(0.5 mg/L)显著提升了MFC的电化学性能,增强了电子传递效率;而高浓度SDZ(10 mg/L)则显著抑制微生物的生长和代谢,导致MFC性能下降。
(2)0.5 mg/L SDZ增强了EAB与阳极间的DET过程,并优化了DET与MET的协同作用;10 mg/L SDZ则抑制了DET。
(3)低浓度SDZ通过增加EPS的生成,增强了生物膜的物理稳定性和电子传递通路的有效性,从而提高了EAB的电化学性能;高浓度SDZ则削弱了生物膜的稳定性,导致生物膜密度和电子传递能力降低。
(4)低浓度SDZ显著增加了与电子传递功能相关的微生物的丰度;高浓度SDZ对微生物群落稳定性产生抑制作用,减少了电活性微生物的数量。
(5)首次发现SDZ对微生物胞内电子传递链的影响具有明显的靶向性,其中对复合物IV(细胞色素c氧化酶)的抑制最为显著,这表明SDZ主要通过干扰复合物IV的活性影响微生物的电子传递效率。