胃肠道动力是维持消化系统正常功能的核心机制,其通过协调肠道平滑肌的收缩与舒张、神经信号传递及激素调控,推动食糜在消化道内的运输与吸收。近年来,随着饮食结构改变、老龄化加剧及精神压力增加,胃肠道动力失调疾病的发病率显著上升,如功能性消化不良(functional dyspepsia,FD),功能性便秘(functional constipation,FC)、肠易激综合征(irritable bowel syndrome,IBS),根据流行病学研究显示FD、FC、IBS的患病率分别高达8.4%、11.7%、4.1%
[1-2],其中肠道动力异常是主要病理基础之一,常伴随胃肠激素紊乱,如胃动素(motilin,MTL)分泌减少、血管活性肠肽(vasoactive intestinal peptide,VIP) 异常升高、肠道菌群失衡等
[3-5]。此类疾病多为慢性病,疗程长,传统治疗手段常用一般采用益生菌、促动力剂等治疗
[6],短期内可缓解症状,但长期应用易出现耐药性、腹泻、头痛等不良反应,且复发率高达40%
[7],严重影响着患者的生活质量及康复,并导致医疗资源消耗与社会经济负担加重。根据肠道动力失调的表现,中医可将其归为胃脘痛、痞满、呕吐等, 病因病机为气滞血瘀、脾失健运、胃失和降、气机运行失常
[8]。相较于西药促动力剂单一生理指标干预的模式,中医药可以通过多靶点、多通路调节实现标本兼治,在改善症状(如腹胀、便秘)的同时,兼具副作用小、耐药性低、复发率少的优势,尤其适合慢性病患者的长期调理。此外,针灸、穴位贴敷等外治法具有独特的非侵入性优势深受药物禁忌症病人的喜爱。
离体组织灌流系统是一种通过体外模拟生理环境以维持离体组织或器官活性并研究其功能的实验装置,该系统通过提供恒温环境、营养液、氧气供应,维持离体组织的生物活性,并通过多通道生物信号采集系统实时测量组织在药物或电刺激作用下的张力变化,可用于测量胃电图、心电图,本实验所采用的生物信号采集系统biopac mp160已有文献支撑应用于无创、微创神经电生理领域
[9-10];以其高效性、可控性为胃肠平滑肌动力研究提供了从分子机制到整体功能的多层次分析工具。
隔山消积颗粒由苗药隔山消和马兰草配伍后制备,具有消积行气功效,可用于脾胃气滞所致的食积内停, 脘腹胀痛,不思饮食,嗳腐吞酸。隔山消为萝藦科植物耳叶牛皮消(
Cynanchum auriculatum Royle ex Wight.)的干燥块根,研究报道其提取物具有抗炎、抗真菌、抗肿瘤、调节胃肠运动、免疫调节等作用
[11-13]。马兰草为菊科植物马兰[
Kalimeris indica(L.)Sch.Bip.]的干燥全草,其性味辛、苦、寒,具有凉血止血、清热利湿、解毒消肿的功效,报道其可用于痢疾、肠炎
[14],药理学研究显示它有抗炎、镇痛、保肝作用
[15]。根据隔山消积颗粒的功能主治,推测其有促进胃肠动力的作用。目前鲜见对隔山消积颗粒整方在胃肠动力方面的基础药理研究报道,影响了其临床应用推广,亟需进行相关研究。
因此,现首先通过血清药理学方法,运用离体组织灌流系统评价隔山消积颗粒对胃肌能的直接作用,再结合体内胃肠运动试验评价隔山消积颗粒对胃肠运动的整体影响及潜在机制,初步探讨其调节胃肠运动的作用,从局部到整体多角度进行研究,为该品种的临床应用提供科学依据。
1 实验材料与仪器
1.1 实验动物
昆明种小鼠,SPF级,体重18~22 g,雌雄各半,购自成都达硕实验动物有限公司,许可证号:SCXK(川)2020-030;Sprague-Dawlay(SD)大鼠,SPF 级,雌雄不拘,体重180~220 g,成都达硕实验动物有限公司,动物生产许可证号:SYXK(川)2022-030。动物饲养于成都中医药大学药学院实验动物房(使用许可证号:SYXK(川)2020-0124。本次研究方案通过了成都中医药大学实验动物福利伦理委员会的审批,审查号为2024010。
1.2 实验药品与试剂
隔山消积颗粒浸膏,由红云制药(贵州)有限公司提供,批号JGw3-2023w9,浸膏中生药含量3.56 g/g,临床成药(隔山消积颗粒)每10 g含4 g生药,推荐用量为1次10~20 g,每日3次。健胃消食片,江中药业股份有限公司生产,批号22098013;吗丁啉,西安杨森制药有限公司生产,批号MCJ3752。小鼠胃泌素(GT)和血管活性肠肽(VIP)ELISA试剂盒,均由Elabscience公司生产,批号分别为ZD074PRJ0554、ZD03022V6594;胃动素(MTL)的ELISA试剂盒由南京建成生物有限公司生产,批号20230412。1.5%异氟烷,20251015,RWD;羧甲基纤维素钠,2018022601,成都市科隆化学品有限公司;蔗糖,2022053001,成都市科隆化学品有限公司;淀粉,2022072101,成都市科隆化学品有限公司;奶粉,CR2209094,Servicebio;颗粒活性炭,重庆茂业化学试剂有限公司生产;氯化钠,2023052301,成都市科隆化学品有限公司;氯化钾,SLBH5524V,Sigma;氯化钙,2017102001,成都市科隆化学品有限公司;碳酸氢钠,2023042501,成都市科隆化学品有限公司;磷酸二氢钾,2018050401,成都市科隆化学品有限公司;七水硫酸镁,2022050501,成都市科隆化学品有限公司;无水葡萄糖,2022122301,成都市科隆化学品有限公司。
克-亨氏液(K-H液)的配制:每1 000 mL溶液按
表1称取相应试剂,除葡萄糖和CaCl
2外,其他试剂溶解在蒸馏水中,最后加入葡萄糖和CaCl
2,充分搅拌溶解完全。
半固体糊的配制:精密称取羧甲基纤维素钠5 g,溶于125 mL 蒸馏水中,加入奶粉8 g, 蔗糖4 g,淀粉4 g,活性炭末1 g搅拌均匀配制成150 mL 的黑色半固体糊状物(1 g/mL),冰箱冷藏,用时恢复至室温。提前一天配制
[16]。经测得配营养糊0.6 mL 约为0. 623 7 g。
1.3 实验仪器
冷冻离心机,TGL-21M,上海卢湘仪离心机仪器有限公司;分析天平,BCE224I1CCN,赛多利斯科学仪器(北京)有限公司;酶标仪,SPerctraMax ABS Plus,美国 Molecular Devices;离体组织灌流系统,PL3508B5/C-V,Radnoti;离体平滑肌生理信号测量系统,MP160,BIOPAC;AcqKnowledge 5.0.8;恒温水浴锅,SY-1210,精骐;万分之一天平, BCE224i-1 CCN,赛多利斯;优普超纯水机,成都超纯科技有限公司,UPH-II-20T。
2 实验方法
2.1 大鼠离体胃肠平滑肌收缩活动试验
2.1.1 隔山消积颗粒含药血清的制备
SPF级SD大鼠20只,雄性,分为空白血清组与含药血清组,每组10只。参考文献方法制备含药血清
[17]:将隔山消积颗粒(GSXJG)浸膏用纯水按生药浓度配置为2 g/mL,含药血清组大鼠按20 g/kg灌胃3 d,每日1次,空白血清组灌胃等体积纯水。最后一次灌胃1.5 h后,采用1.5%异氟烷麻醉大鼠行腹主动脉采血,血液静置2 h,3 500 r/min离心15 min,获得血清,-20 ℃保存待用。
2.1.2 大鼠离体胃平滑肌试验
取SPF级SD大鼠,雌雄不拘,体重180~220 g。适应性喂养3 d,实验前禁食不禁水 24 h。然后脱颈椎处死大鼠,迅速剖取全胃置于预冷的K-H 液中,沿胃小弯剖开并漂洗干净,分离胃底、胃体、胃窦,分别切取肌条标本,置于含有K-H液的浴槽中,浴槽温度维持在(37±0.5) ℃,标本一端固定在支架上,另一端接于张力换能器,持续供应95%O2和5%CO2的混合气体,给予0.5 g的前负荷。每20 min更换一次新鲜的 K-H 液,平衡1 h,记录肌条收缩活动 10 min,随后按累积加药法给予隔山消积颗粒含药血清20、40、80、160、320 μL,每次加药间隔10 min,记录不同给药浓度时胃肠平滑肌舒缩张力,并分别计算促进率:促进率=(给药后-给药前)/给药前×100%。
2.2 小鼠体内胃肠运动试验
取SPF级昆明种小鼠70只,雌雄各半,适应性喂养3 d后,按体重随机分为空白组、健胃消食片组(1.20 g/kg)、吗丁啉组(6.0 mg/kg)、隔山消积颗粒低剂量组(5.00 g/kg)、中剂量组(10.00 g/kg)、高剂量组(20.00 g/kg),每组10只小鼠。各药物组给予相应的药物灌胃10 mL/kg,空白组灌胃去离子水,每日1次,连续3 d。末次给药前禁食不禁水24 h,去除垫料,末次给药1 h后,所有小鼠灌胃半固体糊0.6 mL/只,灌营养糊30 min后所有小鼠行眼眶采血,然后立即脱颈椎处死,打开腹腔,用尼龙线结扎胃幽门和胃贲门,取出胃和小肠(幽门前端至回盲部),按照文献[
18]的方法进行胃残留率和肠推进测定。所取血液静置40 min,3 500 r/min 离心15 min,分离血清,ELISA法测定血清胃动素(MTL)、胃泌素(Gastrin,GAS)、血管活性肽(VIP) 含量。
2.3 数据分析
采用SPSS 25.0统计软件进行数据分析;计量资料以均数±标准差表示,多组间比较采用单因素方差分析(One-way ANOVA),两组间的比较采用独立样本T检验,自身前后比较采用配对T检验;P<0.05表示差异具有统计学意义。
3 实验结果
3.1 对大鼠离体胃平滑肌收缩活动的影响
如
图1、
图2和
表2~
表4所示,空白血清组(KB-B)胃窦、胃体平滑肌张力均逐渐下降,胃底张力逐渐上升,其均值、最大值、最小值在40、80、160、320 μL剂量时均有显著提升(
P<0.05,
P<0.01)。隔山消积颗粒含药血清组(GSXJG-B)胃窦平滑肌张力逐渐下降,其中均值、最大值促进率较空白血清组有所提升,胃体平滑肌张力呈不规则性提升,促进率均大于空白血清组,胃底平滑肌张力显著提升(
P<0.05,
P<0.01),促进率约为空白血清组的2倍。
3.2 对正常小鼠胃肠运动的影响
3.2.1 对胃排空和肠推进的影响
如
图3和
表5所示,与空白组相比,健胃消食片组肠推进率有升高的趋势,隔山消积颗粒各剂量组肠推进率均升高,且高剂量组较两个阳性药组显著升高(
P<0.01),且呈现剂量依赖性。胃残留率结果无统计学意义,与健胃消食片组相比,隔山消积颗粒中剂量、高剂量组有所降低,且呈剂量依赖性,但隔山消积颗粒低剂量组与健胃消食片组胃残留率较空白组均有所提升,推测为禁食不完全导致。
3.2.2 对正常小鼠胃肠激素的影响
如
图4和
表6所示,与空白组相比,健胃消食片组GAS含量有升高趋势,VIP有降低趋势,MTL基本无变化;隔山消积颗粒各剂量组的MTL均显著升高(
P<0.05,
P<0.01),且亦显著高于健胃消食片组(
P<0.05,
P<0.01),各组的GAS也呈升高趋势,对VIP的影响表现为,低剂量组显著升高(
P<0.05),高剂量组呈降低趋势。从数值看,健胃消食片对GAS的影响波动大、隔山消积颗粒高剂量对MTL的升高最显著。
4 讨论
消化功能是维持人体生命活动的核心生理功能,与胃肠运动密不可分。胃肠通过神经、肠肽激素等多重调节
[19],机器性地蠕动将食物研磨向下输送,同时配合消化酶的化学分解作用,将大分子营养物转化为可吸收的小分子,这一过程是能量代谢和细胞修复的起点,直接影响机体的生长发育、免疫功能和代谢稳态
[20]。胃肠动力障碍可导致营养吸收不良,引发贫血等多种疾病;同时也是多种疾病(胃麻痹、肠梗阻)的表现症状之一,其主要表现为胃排空延迟
[19]。胃肠运动的协调不仅依赖于平滑肌收缩/舒张的动态平衡,也离不开肠肽激素的精细调控。胃泌素(GAS)在进食后由G细胞分泌,可促进幽门括约肌平滑肌收缩,增加胃窦张力
[21-22],胃动素(MTL)是由肠道合成的一种神经肽,可促进胃肠运动,提高胃肠道、胆道等的收缩力和张力,能够促进平滑肌收缩,促进胃肠蠕动,其水平过低可导致胃排空延迟
[23];血管活性肽(VIP)是一种抑制性神经递质,具有神经保护和免疫调节作用,能够松弛平滑肌,对胃酸的分泌和胃蠕动均有一定抑制作用,能够延缓胃排空
[24]。长期以来,研究多以胃排空率高作为胃肠动力良好的评价指标,但近年越来越多的实验研究表现出相反的效果。在功能性消化不良模型中,模型小鼠胃排空率反而高于正常组小鼠
[25]。胃排空是一个非常复杂的生理过程,可分为4个阶段,包括滋补收缩、持续收缩、后按和排空
[26]在进食以后,胃底区域紧张性收缩加强,推动食物朝幽门部运动,当幽门括约肌收缩时,则又会推动消化液返回胃中消化食物,如此反复直至食物被消化成小颗粒,最终幽门部打开,食糜流向十二指肠
[27],可消化固体会在饭后2~3 h的消化期被清空
[28]。由此可见食物的消化离不开胃内不同平滑肌协调运动,胃排空过程依赖着胃底的收缩与幽门、胃窦部的舒松,而不只是单一地促进胃各部位平滑肌收缩。此外,营养含量、食物量、卡路里、黏度和加工程度,都会影响消化率,这与它们对胃排空率的影响有关,食物黏度增加会延缓胃排空。因此在分别进行灌胃固体营养糊法和液体酚红法测定胃排空时可能会引起较大差异。常用评估胃动力方法还有在体胃肠超声、植入式生理电极以及离体胃组织灌流法
[29-30],均可采集胃电生理信号。离体平滑肌在评价药物药效反应上具有直观性优势。离体组织灌流技术已有广泛文献报道在药物对组织器官(血管、气道、胃、子宫等)多种平滑肌运动上的研究
[31-34],为高通量药物筛选和复杂调控网络的解析提供了可能。在药物胃动力的评价中, 离体平滑肌试验因具有直观展示、直接作用的优点而常用。中药成分复杂,所含杂质、pH等对离体平滑肌有一定干扰,因此制备含药 血清进行此类体外肌能试验更符合临床用药特点。基于此,选择了体外离体组织方法进行评价,在此基础上采用正常小鼠实验进行整体药效观察。
在本次实验中,正常大鼠血清和隔山消积颗粒含药血清均可兴奋大鼠胃底平滑肌运动,且从促进率看隔山消积颗粒含药血清组的兴奋作用约为正常血清的2倍,表明隔山消积含药血清有兴奋胃底平滑肌作用;同时从促进率看含药血清在最大给药体积时有兴奋胃体平滑肌趋势;对胃窦平滑肌张力最小值呈抑制效应,即胃窦平滑肌基础张力呈下降趋势;胃窦平滑肌呈松弛效应,基础张力有下降趋势。该实验结果表明,隔山消积颗粒可提高胃底张力和促进胃底强收缩、胃体温和收缩及胃窦松弛,从而降低阻力加速排空,这与胃排空后期生理效应相符,提示隔山消积颗粒是通过多靶点协同模拟胃动力自然节律。
在正常小鼠胃肠运动试验中,各给药组肠推进率较空白组均有所提升,其中,隔山消积颗粒高剂量组最为明显(P<0.01);但各给药组的胃残留率均高于空白组小鼠,显示给药后胃排空率反而降低,推测原因,在给药1 h后给予半固体营养糊,30 min后测定胃残留,可能此时正处于胃排空的反复收缩混合食物与胃液阶段,未到主要排空期,在此时刻测定胃排空也许有所不妥,在体后续可考虑更换方法对此指标进行测定。在胃肠激素方面,各给药组均能有效提升血清GAS、MTL水平,其中隔山消积颗粒各组提升MTL水平显著(P<0.05,P<0.01)。对于血清VIP,较空白组,健胃消食片组和隔山消积颗粒高剂量组可以降低血清VIP水平,但隔山消积颗粒低剂量组VIP水平确明显提升,提示隔山消积颗粒对调节血清肠肽激素机制复杂,这与离体实验显示隔山消积颗粒含药血清在不同剂量下对胃不同部位平滑肌呈双向调节作用,同样体现了血清胃肠激素结果的双向性。
5 结论
通过离体大鼠胃平滑肌运动实验与正常小鼠胃肠运动及胃肠激素检测实验,对隔山消积颗粒的胃肠动力调节作用及机制进行了系统探究,获得了贴合药理作用的实验数据,可得出以下结论。
(1)隔山消积颗粒含药血清可兴奋大鼠胃底平滑肌、松弛胃窦平滑肌,通过提高胃底张力与收缩、降低胃窦阻力加速胃排空,多靶点协同模拟胃动力自然节律,与胃排空后期生理效应相符。
(2)隔山消积颗粒可提升小鼠肠推进率,其中高剂量组效果极显著;本次胃残留率检测结果显示给药组胃排空率降低,推测与检测时间处于胃排空混合阶段、未到主要排空期相关,该指标需更换方法后续验证。
(3)隔山消积颗粒可有效提升小鼠血清胃肠运动促进性激素胃泌素(GAS)、胃动素(MTL)水平,对 MTL的提升作用尤为显著,提示隔山消积颗粒对胃肠动力的促进作用与调节相关肠肽激素有关;对血清血管活性肠肽(VIP)的调节呈现双向性,高剂量组降低 VIP 水平、低剂量组显著提升 VIP 水平,结合离体实验其对胃不同部位平滑肌的双向调节作用,提示其调节血清肠肽激素的机制具有复杂性。
综上,隔山消积颗粒可直接调节胃不同部位平滑肌舒缩来促进胃排空运动,并可通过调节胃肠激素水平间接调节胃肠动力,整体作用明确且调节机制具有多靶点、双向性的特点,填补隔山消积颗粒调节胃肠动力研究方面的空白,为其临床应用及推广提供实验依据。
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