高血压是一种主要表现为体循环动脉血压增高的心血管综合征
[1]。中国高血压患病率持续升高,约有2.45亿人患有高血压
[2]。研究表明,中国每年死于心血管疾病的人数为300万,其中约半数死亡原因与高血压相关
[3]。若不对高血压进行早期干预,长期血压升高损伤心、脑、肾等器官,严重影响人体健康和生活质量
[4]。现代医学治疗高血压以降低血压为目标,较少涉及评估和控制症状,且多种降压药联合使用的方案容易使患者产生抵触心理,降低患者依从性
[5-6]。中医药不仅能够平稳降血压,还能改善症状,逆转危险因素,保护靶器官,甚至能使部分患者达到减量或停用西药的疗效
[7-8]。依据《高血压中医诊疗专家共识》
[9],高血压属于中医学“眩晕”“头痛”等范畴,《内经》认为眩晕属肝所主,如《素问·至真要大论》云:“诸风掉眩,皆属于肝”,历代医家大多倡导从肝风、肝阳论治。
“清肝通络饮(Qinggantongluoyin,QGTLY)”是治疗高血压的临床经验方,由天麻钩藤饮化裁而来,由钩藤、野菊花、夏枯草、决明子、牛膝、地龙、僵蚕、桑寄生、黄芩、炒栀子、丹参、益母草、杜仲、桑枝、威灵仙、茯苓16味中药组成,共成清肝火、通络逐瘀之剂,用于治疗肝火型高血压。临床观察表明,清肝通络饮可以有效缓解头痛、头胀等症状,控制血压,兼有降脂的功效
[10]。动物实验证实,清肝通络饮能改善自发性高血压大鼠心脏形态,提高心脏功能,减轻左心室肥厚
[11]。但由于清肝通络饮组成复杂,其作用的分子机制尚不清楚,在一定程度上限制了其在临床中的应用和推广。鉴于此,现通过网络药理学与分子对接技术
[12]分析QGTLY的核心成分及其在疾病网络中的作用机制,阐述其对信号通路的多途径调节,以期为药物的进一步研究提供新的实验方向。
1 研究方法
1.1 药物活性成分及靶点获取
通过TCMSP数据库(
https://tcmsp-e.com/)和TCM-ID数据库(
https://www.bidd.group/)输入QGTLY所含中药名称获取药物的成分及相关靶点。设定口服生物利用度(oral bioavailability, OB)≥30%,类药性(drug-likeness, DL)≥0. 18,得到符合条件的活性成分并导出结果,在“RelateTargets”中获取相关靶点并在UniProt(
https://www.uniprot.org/)数据库中转化成对应的基因进行汇总。
1.2 疾病靶点筛选及交集基因获取
在GeneCards(
https://genealacart.genecards.org/)与OMIM数据库(
https://www.omim.org/)中将“Hypertension”作为检索词查找,设置物种为“homo sapiens”,收集高血压疾病靶点,选择“Reviewed”蛋白。将所有疾病靶点进行汇总,删除重复值,得到与高血压相关的靶点。通过微生信网站(
https://www.bioinformatics.com.cn/)绘制Venny图,并得到药物靶点和疾病基因的交集基因。
1.3 绘制药物-活性成分-靶点图
将药物活性成分与靶点基因导入 Cytoscape 3.10.2软件,构建“清肝通络饮-活性成分-靶点图”,获得度Degree值的大小,并统计该节点作用大小以及与其他节点的相关性。
1.4 PPI网络构建
在STRING平台(
https://cn.string-db.org/)中对交集基因进行蛋白互作分析,设定物种为“homo sapiens”,最低相互作用阈值(medium confidence)0.4,其他为默认参数。去除单独靶点基因,导出蛋白互作网络(protein-protein interaction,PPI)数据,通过Cytoscape3.10.2中的CytoNCA进行网络拓扑分析,筛选出关键靶点基因。
1.5 GO与KEGG富集分析
将核心靶点基因导入DAVID数据库后进行GO(gene ontology)与KEGG(Kyoto encyclopedia of genes and genomes)富集分析,选定P<0. 05 作为筛选条件,根据P值大小排序,分别选择生物过程(biological processes,BP)、细胞组分(cellular components,CC)、分子功能(molecular function,MF)的前10组,KEGG的前20组。在微生信网站绘制富集分析柱状图和气泡图以展示富集结果。
1.6 分子对接验证
通过PubChem数据库(
https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)检索药物活性成分以获取其高分辨率的2D蛋白结构,并应用OpenBabel2.4.1软件转化为3D结构,在PDB数据库(
https://www.rcsb.org/)获取核心基因的3D结构。选用Pymol3.8.10与AutodockTools1.5.7软件进行去水和溶剂分子、加全氢、设置受体、配体等对接前准备,用AutodockTools1.5.7软件将核心成分与关键基因的蛋白结构对接,获得结合能数值,并通过Pymol3.8.10软件进行可视化分析。
2 结果
2.1 清肝通络饮有效成分及靶点基因
以OB值和DL值为依据在TCMSP数据库中进行筛选后得到钩藤(Uncaria rhynchophylla (Miq.) Miq. ex Havil.)33种、野菊花(Chrysanthemum indicum L.)12种、夏枯草(Prunella vulgaris L.)11种、决明子(Senna tora (L.) Roxb.)13种、川牛膝(Cyathula officinalis K. C. Kuan)4种、黄芩(Scutellaria baicalensis Georgi)36种、栀子(Gardenia jasminoides J.Ellis)15种、丹参(Salvia miltiorrhiza Bunge)65种、益母草(Leonurus japonicus Houtt.)8种、杜仲(Eucommia ulmoides Oliv.)28种、桑枝(Ramulus Mori)3种、威灵仙(Clematis chinensis Osbeck)7种、茯苓(Wolfiporia cocos)15种、桑寄生(Taxillus sutchuenensis (Lecomte) Danser)2种活性成分,在TCM-ID数据库检索地龙(Pheretima)、僵蚕(Bombyx Batryticatus),并将所获得活性成分在TCMSP数据库中进行匹配得到地龙14种、僵蚕22种活性成分,删除重复值后合计247种有效成分和344个靶点基因。
2.2 高血压疾病靶点和交集基因筛选
应用GeneCards、OMIM数据库分别检索高血压靶点基因,以
P值为筛选标准连续取3次均值进行筛选,共获得1 043个靶点基因。将高血压靶点基因与药物靶点基因在微生信网站中取交集共获得124个交集基因,并绘制Venny图,如
图1所示。
2.3 清肝通络饮-活性成分-靶点图的构建
将2.1节中获得的药物有效成分及靶点基因导入Cytoscape3.10.2软件构建“清肝通络饮-活性成分-靶点图,如
图2所示。以度(Degree)值大小排列,quercetin、kaempferol、beta-sitosterol、luteolin分别是前4位的活性成分,为清肝通络饮改善高血压的可能核心成分。
2.4 PPI 网络构建
在STRING网站中导入清肝通络饮与高血压的交集基因,得到124个节点、4 684条边的PPI网络图。导出PPI数据并在Cytoscape3.10.2中进行可视化,如
图3所示。应用CytoNCA 插件进行拓扑分析,以Degree值、介度中心性(intermediate centrality,BC)等为筛选标准,筛选出核心靶点基因,筛选过程如
图4所示,筛选出排名前5的靶点依次为
PTGS2、
PPARG、
IL1B、
AKT1、
MMP9。
2.5 GO、KEGG 富集分析结果
GO富集分析显示,BP共712条,其中涉及MAPK级联正向调节(positive regulation of MAPK cascade)、氧化应激(response to hypoxia)等;CC共58条,涉及细胞外空间及区域(extracellular space and region)等;MF共134条,涉及酶(enzyme binding)、相同蛋白结合(identical protein binding)等,将BP、CC以及MF各列出前10条,如
图5所示。KEGG 富集分析显示,主要包含糖基化终末产物-糖基化终末产物受体(AGE-RAGE)、流体剪切应力和动脉粥样硬化(fluid shear stress and atherosclerosis)、HIF-1信号通路等154条生物学途径,列出前20条,如
图6所示。
2.6 高血压-通路-清肝通络饮-活性成分-潜在靶点网络图构建
将2.5节中得到的20条疾病通路以及2.4节中得到的124个药物作用靶点导入Cytoscape 3.10.2软件中,构建高血压-通路-清肝通络饮-活性成分-潜在靶点网络,并进行可视化分析,如
图7所示。
2.7 分子对接验证结果
依据结合能<-5.0 kJ/mol有较强的结合活性进行分析,将清肝通络饮治疗高血压的4个核心成分和5个核心治疗靶点的蛋白结构分别进行分子对接,共获得20对对接结果,如
表1所示。其中beta-sitosterol与
MMP9的结合能力最强(-8.94 kJ/mol),luteolin与
MMP9的结合也较紧密(-8.48 kJ/mol)。具体分子对接模式如
图8所示。
3 讨论
清肝通络饮是由天麻钩藤饮化裁而来,用于治疗高血压的经验方,方中钩藤、决明子平肝降压,栀子、夏枯草、菊花、决明子、黄芩清泻肝火;桑寄生配伍杜仲、牛膝补益肝肾以平肝降压,牛膝作为引经药还可导热下泄,引火下行,以降上亢之阳、上炎之火;地龙、僵蚕入络搜邪;丹参、益母草、威灵仙活血通络;益母草配伍茯苓,利水以防血瘀化水。诸药合用,共奏清肝泻火,逐瘀通络之功。实验研究表明,清肝通络饮在血压控制方面展现出显著疗效,同时可有效缓解患者临床症状,此外还具有调节脂质代谢的功能,有助于减少心血管并发症发生风险,延缓靶器官病理损害的进展速度,改善预后
[10]。
网络药理学结果显示,清肝通络饮发挥作用的关键药效成分包括槲皮素、山柰酚、β-谷甾醇、木犀草素等。内皮功能障碍是高血压进程中的核心部分,以炎症反应、血栓倾向和血管舒张异常为特征,通过压力水平与血管变化及神经体液激活,促进血管重塑和阻力增加,形成血压持续升高的病理基础
[13]。槲皮素低浓度时主要作用于内皮细胞,对内皮完整血管环有内皮依赖性舒张作用,能抑制NA或KCl引起的收缩,其机制是激活内皮钙通道,增加细胞内钙,激活NO合成酶,促进NO合成从而舒张血管而起到抗高血压病的作用
[14]。研究表明,山柰酚能显著降低血压,改善肾功能,减轻纤维化损伤、肾内炎症和氧化应激
[15]。同时,山柰酚还被证明能抑制血管紧张素转换酶(将血管紧张素 I 转换为血管紧张素 II 并导致血压升高),诱导血管扩张作用
[16]。β-谷甾醇属植物甾醇,具有降低血清胆固醇水平、抗炎、抗氧化应激等生物活性
[17]。研究表明,其通过阻止氧化低密度脂蛋白诱导的人主动脉内皮细胞凋亡,可明显降低内皮细胞中
IL-1β、
IL-6水平,并能抑制Ang II(angiotensin II)诱导的VSMCs(vascular smooth muscle cells)的增殖和迁移,降低细胞内氧化应激
[18],这些生物活性的调控使其在高血压病的防治中具有潜在临床应用价值。木犀草素为一种常见的黄酮类化合物,可降低EH(spontaneous hypertensive rat)大鼠的血压
[19],还可改善主动脉环的血管舒张
[20]。
通过蛋白互作网络分析得出,前列腺素内过氧化物合成酶2(
PTGS2)、过氧化物酶体增殖物激活受体γ(
PPARG)、白介素-1β(
IL-1β)、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶1(
AKT1)、血清基质金属蛋白酶9(
MMP9)等是清肝通络饮改善高血压的核心基因。研究表明,PTGS通过特异性结合血小板及血管内皮细胞表面的前列环素受体(G蛋白偶联受体),激活G蛋白偶联的cAMP-PKA信号通路,抗血小板聚集,并诱导血管平滑肌松弛
[21],其中
PTGS2基因与女性高血压疾病的病理进程存在显著相关性
[22]。
PPARG 可通过抑制NF-κB起到减轻心肌缺血后心肌损伤程度的作用
[23]。同时,研究证实
PPARG具有降压作用,其机制涉及对AGTR1表达的抑制及血管紧张素II介导的RAS(renin-angiotensin system)信号通路的负向调控
[24]。
IL-1β与其他炎症因子形成正反馈环路,一方面促进脂质代谢紊乱[表现为TC(total cholesterol)、TG(triglyceride)、LDL-C(low-density lipoprotein cholesterol)及ox-LDL(oxidized low-density lipoprotein)升高];另一方面通过激活VSMCs增殖信号(如NF-κB/MAPK通路),导致血管壁增厚,共同推动动脉粥样硬化斑块形成与发展
[25]。研究表明,
AKT1信号通路与原发性高血压密切相关
[26]。庞冰瑶
[27]研究发现,PI3K/Akt信号通路通过调控血管平滑肌细胞增殖、凋亡、迁移及氧化应激,在心肌缺血再灌注损伤中发挥核心保护作用,其亚型
AKT1介导的心脏组织特异性调控尤其显著。
MMP9介导的ECM(extracellular matrix)重塑在动脉粥样硬化进展中起关键作用:其蛋白水解活性导致纤维帽变薄、斑块稳定性降低,同时加剧局部炎症反应,最终导致斑块破裂及继发性血栓形成
[28]。
KEGG分析显示,AGE-RAGE、流体剪切力与动脉粥样硬化(fluid shear stress and atherosclerosis)、HIF-1信号通路为清肝通络饮治疗高血压的关键生物学途径。研究证实,AGE通过双重机制参与高血压的发生发展
[29]。一方面,在非受体介导机制中,通过调控血管活性物质改变血管功能
[30];另一方面,在受体介导的机制中,AGEs(advanced glycation end products)通过与细胞表面RAGE(receptor of advanced glycation end products)结合,触发下游信号转导级联反应,包括NADPH氧化酶介导的ROS生成增加。升高的ROS水平进一步激活NF-κB信号通路,促进促炎细胞因子(如TNF-α、IL-6)和黏附分子(如VCAM-1、ICAM-1)的转录上调,最终导致血管炎症反应和内皮功能障碍,参与高血压的病理进程
[31]。血流剪切力(fluid shear stress,FSS)是调节动脉内皮结构和功能的关键因素,提高低水平FSS可改善血管内皮异常力学环境,阻止动脉粥样硬化的形成和发展
[32]。内皮功能障碍作为动脉粥样硬化的始动环节,其介导的血管损伤与炎症反应可驱动高血压的病理进程。FSS作为调节内皮炎症的重要因素,低血流剪切力可激活NF-κB和MAPK信号通路从而增加炎症因子(如TNF-α、IL-1β)、趋化因子和黏附分子等的表达,增强内皮细胞的黏附能力,引起内皮功能障碍,促进高血压的发生发展
[33]。HIF-1是一种缺氧诱导因子,广泛存在于心肌和血管组织中,在缺氧条件下,心肌细胞应对缺氧适应与修复主要是通过HIF-1α(hypoxia inducible factor-1α)来实现的。研究表明,HIF-1α信号通路通过调控ROS处理、血管生成和细胞增殖等参与心血管疾病的发病
[34]。IL-6作为常见的炎性细胞因子,在高血压病理进程中呈现表达上调。IL-6升高后会刺激各种炎症因子的合成与释放,刺激巨噬细胞发挥抗炎作用,而HIF-1在巨噬细胞内参与调节炎性反应,在此过程中HIF-1α被消耗,影响其对细胞适应氧化应激损伤的调节,最终加剧血管炎症反应和血压的升高
[35]。黄灵琳等
[36]研究发现,半夏白术天麻汤通过抑制HIF-1α/VEGF/VEGFR2信号通路,可改善高血压合并颈动脉粥样硬化斑块患者的血压及血脂水平。李志情等
[37]研究表明,槲皮素、山柰酚、木犀草素等成分主要作用于
AKT1、
TNF、
IL6等靶点基因调控脂质和动脉粥样硬化相关通路、HIF-1信号等通路以改善动脉粥样硬化。
4 结论
综合运用网络药理学与分子对接技术,系统揭示了清肝通络饮通过“多成分-多靶点-多通路”的协同作用模式治疗高血压的潜在分子机制。研究结果显示,清肝通络饮中槲皮素、山柰酚、β-谷甾醇、木犀草素等潜在活性成分,通过AGE-RAGE通路、流体剪切力与动脉粥样硬化(fluid shear stress and atherosclerosis)等生物学途径,PTGS2、PPARG、IL1B、AKT1、MMP9等靶点结合,通过改善血管平滑肌渗透性,调节血管活性物质,抗氧化应激,控制炎症反应等降压及缓解临床症状。研究成果不仅为清肝通络饮治疗高血压提供了现代科学依据,也为其临床推广应用奠定了理论基础。基于目前生物信息数据库对清肝通络饮治疗高血压的分子机制做出合理预测,具有一定的局限性,未来仍需在现有研究的基础上开展更为深入的实验与临床研究加以验证。
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