铀(U)的化学毒性及放射毒性可造成多器官损伤,现广泛使用的螯合剂疗法对沉积于器官的U促排效果不佳,且具有一定毒性。甘草作为传统中药,具有多种生物活性,甘草酸对铀有一定的促排作用。随着核技术与辐射应用的广泛发展,铀工业所带来的人体铀暴露风险日益增加。铀通过呼吸道和消化道进入人体后,主要沉积于肾脏和骨骼,引发多器官毒性
[1-6]。铀兼具化学毒性和放射毒性,可通过诱导活性氧(reactive oxygen species,ROS)大量生成导致氧化损伤,并干扰骨代谢平衡,对机体形成潜在的健康威胁
[7-8]。目前临床针对铀损伤的干预手段较为有限,常用螯合剂如Zn-DTPA等对已沉积于组织器官的铀清除,效果不佳,且它们多为化学合成药物,具有一定的生物毒性
[9-12],因此,开发安全、有效且能够多靶点干预铀损伤的新型防治药物成为该领域的重要研究方向。
中外学者在铀毒性机制及促排药物方面已开展较多研究。国外研究表明,铀暴露可导致肾脏近端小管上皮细胞损伤、甲状腺功能异常以及全身性氧化应激反应
[3-5];在促排药物方面,除了传统螯合剂,近年来也涌现出如麦芽酚衍生物、3,4,3-LI(1,2-HOPO)等新型配体,其在动物模型中显示出一定的促排效果,但靶器官保护作用和长期安全性仍有待深入验证
[9,12]。中国研究则更多关注于铀致肾损伤的分子机制及中药干预潜力,张瑞等
[6]发现硫化氢可通过缓解羰基应激拮抗铀诱导的肾毒性,朱金寿等
[7]则从代谢组学角度探讨了偕胺肟类化合物的铀促排作用。这些研究为认识铀毒性及开发防治药物提供了重要基础,但仍缺乏从整体代谢网络角度系统阐释中药多成分、多靶点修复铀损伤的机制研究。
甘草作为一种传统中药材,化学成分丰富,主要活性成分包括甘草酸、甘草次酸及黄酮类化合物等,具有抗炎、抗氧化、免疫调节等多种药理活性,展现出潜在的辐射防护作用
[13]。文献[
14]表明,甘草酸可通过激活Nrf2/ARE信号通路增强抗氧化酶活性,有效缓解氧化应激损伤,提示其对铀损伤可能具备修复潜力。然而,目前关于甘草水提物对铀致代谢紊乱的整体调节作用及其系统性的机制研究尚属空白。
基于此,现采用气相色谱-质谱联用(gas chromatography-mass spectrometry, GC-MS)非靶向代谢组学技术,结合多元统计分析和通路富集方法,系统考察甘草水提物对铀损伤大鼠的修复效应。不仅关注传统毒理学指标(如体重、血象和脏器指数),更从整体代谢轮廓层面揭示甘草水提物的调节作用,旨在阐明其通过缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸生物合成、不饱和脂肪酸代谢、乙醛酸及二羧酸代谢和甘氨酸-丝氨酸-苏氨酸代谢等关键通路发挥多靶点保护作用的机制。首次从代谢网络整体调控角度阐释甘草水提物修复铀损伤的机制,不仅可为理解中药系统性药理作用提供新视角,也可为推动中药从经验性用药向机制明确的多靶点治疗转化提供科学依据,对开发具有自主知识产权的新型铀损伤防治药物具有重要意义。
1 材料
1.1 动物
采用无特定病原体(specific pathogen free,SPF)级雄性(Sprague-Dawley,SD)大鼠,共48只,购自北京斯贝福实验动物技术有限公司,动物合格证号:SCXK(京)2019-0010。实验动物初始体重为(180±10) g。大鼠饲养环境温度控制在(25±1) ℃,相对湿度维持在45%~60%,并进行12 h光照/12 h黑暗循环。实验期间,所有大鼠均可自由获取基础饲料和饮用水,并进行为期5 d的适应性喂养。本实验动物研究经机构动物护理与使用委员会批准(IACUC批准号:IACUC-DEZX-2022-586),严格遵循国际公认的实验动物使用与护理规范。
1.2 仪器
气相色谱-质谱联用仪(GCMS-QP2010SE,日本岛津公司);全自动血液细胞分析仪(BC-2600, 深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司);高速冷冻离心机(fresco 21, 美国赛默飞科技有限公司);全景切片扫描仪[PANNORAMIC DESK/MIDI/250/1000, 3DHISTECH(Hungary)];恒温水浴锅(B-260, 上海亚荣生化仪器厂);电子天平(BP211D, 德国Sartorius公司);旋转蒸发器(RES2CS-2, 上海亚荣生化仪器厂);涡旋仪 (QL-901vortex, 海门市其林贝尔仪器制造有限公司);离心机 (IDZ5-2, 上海安亭科学仪器厂);超声波清洗机 (SB-5200DTDN, 宁波新艺生物科技股份有限公司);氮吹仪 (NV-15G, 成都赛斯特仪器仪表有限公司);扫描浏览软件[CaseViewer2.4,3DHISTECH(Hungary)]。
1.3 药物与试剂
甘草:(产地内蒙古,批号240701,购自安徽惠丰国药有限公司);乙酸氧铀(上海吉至生化科技有限公司);0.9%氯化钠注射液(石家庄四药有限公司);Zn-DTPA(批号202206,军科院自制)。
衍生化试剂(BSTFA+TMCS(99∶1)赛默飞科技(中国)有限公司);M-3D 稀释液(迈瑞南京生物技术有限公司);正庚烷(TCI 上海化成工业发展有限公司);超干吡啶(P2500, 北京伊诺凯科技有限公司);甲醇(美国 Sigma-Aldrich 化工有限公司)。
普通氮气(纯度≥99.2%),高纯氦(纯度≥99.999%)购自北京环宇京辉京城气体科技有限公司。
2 方法
2.1 药品制备
称取甘草饮片4.5 kg,粉碎,分别用12倍量的蒸馏水回流提取2次,每次2 h,滤过,混合2次滤液,减压浓缩,冷冻干燥得252 g粉末,保存于4 ℃冰箱备用。
2.2 动物模型建立及给药过程
采用随机数字表法将48只大鼠分为空白对照组(ctrl)、模型组(MG)、阳性药Zn-DTPA组(AD)、 LWE 1 g/kg组(LD)、5 g/kg组(MD)、10 g/kg组(HD)。大鼠常规饲养5 d适应环境。模型组(MG)大鼠通过尾静脉注射3 g/kg的乙酸氧铀;阳性药Zn-DTPA组(AD)大鼠在尾静脉注射3 mg/kg乙酸氧铀之后,即刻尾静脉注射43.66 mg/kg的Zn-DTPA;给药组先尾静脉注射3 mg/kg的乙酸氧铀,随后依据各自不同剂量,分别灌胃给予相应药物。连续给药7 d。给药期间,其余各组(除各给药组外)大鼠均按照给药组的剂量,灌胃等体积的0.9%氯化钠注射液;空白组(ctrl)的给剂量根据其余各给药组的给药体积进行等体积的0.9%氯化钠注射液灌胃。
2.3 大鼠样本采集与处理
2.3.1 样本收集
血液采集:末次给药24 h后大鼠腹腔注射2%戊巴比妥钠(40 mg/kg),待大鼠完全麻醉后,腹主动脉取血,室温放置30 min,待血清析出后以3 000 r/min离心15 min,取上清液,分装,-80 ℃保存备用。
各脏器样本采集:待取血结束后,分离肾脏、肝脏、脾脏、胸腺,采用生理盐水洗净,滤纸吸干水分,称取各脏器质量并记录。
外周血血象检测:于造模后1、3、5、7 d,将大鼠固定于固定器中,尾静脉采血20 μL,使用全自动血细胞分析仪测定外周血血象值。
2.3.2 大鼠血清样本前处理
将取得的血样室温下解冻,取100 μL于2 mL EP管,加1 200 μL甲醇沉淀蛋白,涡旋30 s,超声10 min 混匀,12 000 r/min 离心15 min,取上清液100 μL至2 mL衍生化样品瓶中,氮气吹干后,加20 mg/mL 甲氧胺吡啶盐酸盐溶液50 μL 涡旋超声复溶,70 ℃水浴条件下肟化1 h。冷却至室温,加入衍生化试剂 BSTFA+TMCS(99∶1)50 μL,涡旋30 s,70 ℃水浴条件下衍生化反应1 h。冷却后加入正庚烷100 μL,涡旋30 s混匀,取上清液置进样瓶中待检测分析。
2.4 大鼠血清样本分析
2.4.1 气相色谱条件
Rtx-5MS毛细管柱(0.25 mm×30 m,0.25 μm);进样口温度280 ℃,采用10∶1的分流比,柱流速保持1.0 mL/min;柱温程序如下,起始温度80 ℃(保持 5 min),以5 ℃/min 的速度上升到300 ℃(保持15 min);进样量1 μL,每次进样前洗针3次。
2.4.2 质谱条件
电子轰击离子源(electron ionization source, EI)温度230 ℃;电压70 eV;接口温度280 ℃,四极杆温度150 ℃,采集方式如下,Scan扫描,扫描范围质荷比(m/z)35~500,溶剂延迟时间1 min,溶剂切除为4 min。
2.4.3 数据处理与分析
将GC-MS采集的原始数据转化为“*.mzXML”格式后上传至XCMS online在线数据处理平台进行滤噪、峰识别、峰对齐等,得到保留时间与离子峰强度的数据矩阵进行归一化处理,将得到的离子峰强度数据矩阵导入到SIMCA 14.1进行多元统计分析。数据经过中心化和标度化处理后,采用主成分分析(principal component analysis,PCA)、正交偏最小二乘法判别分析(orthogonal partial least squares discriminant analysis, OPLS-DA),并通过交叉验证法对建立的数据模型进行有效性验证。
通过变量投影重要性值(variable importance in the projection, VIP) >1.0且显著性值P< 0.05结果筛选潜在差异性代谢物。采用PCA/OPLS-DA 分析,并通过交叉验证法对所建立的数据模型进行有效性验证,利用NIST2017质谱数据库和质谱解离规律获取该差异性代谢物的结构信息。
通过GraphPad Prism 8.2.1进行统计分析。每组的实验数据表示为平均值±标准差($\overline{x}$±s)。使用t检验来分析组间差异的显著性。
3 结果
3.1 LWE 对U损伤大鼠质量的影响
由
图1可知,空白组质量无明显变化,模型组经腹腔注射3 mg/kg乙酰氧铀后饮食量下降,尿量增多,造模后第3天体质量显著下降,阳性药组体重变化小于模型组,给药组体重缓慢恢复,且接近空白组(
图1)。
3.2 LWE 对U损伤大鼠外周血象的影响
由
图2(a)可知,大鼠尾静脉注射3 mg/kg乙酸氧铀后,白细胞(white blood cell, WBC)显著升高,第7天降至最低。给药24 h后,各剂量组WBC显著高于对照组,提示造模成功;第3、5、7天,各剂量组WBC显著低于模型组,第7天模型组显著低于其余各组,提示U损伤破坏免疫系统。给药组与模型组差异有统计学意义,提示 LWE 对U损伤大鼠WBC具有恢复作用。由
图2(b)可知,乙酸氧铀注射后,淋巴细胞比率自第1天开始下降,模型组早期因炎症反应,后期因骨髓抑制而降低,整体呈下降趋势。给药组与模型组差异有统计学意义,提示 LWE 对U损伤大鼠淋巴细胞具有恢复作用。
3.3 LWE 对U损伤大鼠脏器指数的影响
乙酸氧铀染毒后,MG组肝脏指数显著降低,肾、肺指数显著增加,脾、胸腺指数降低,提示U致肝、肾、肺损伤及脾、胸腺抑制。Zn-DTPA可减轻各脏器损伤。 LWE 组具保肝作用,MD和HD组显著减轻肝损伤;LWE 组通过抗炎、肾小管保护减轻肾损伤; LWE 组对脾、胸腺具免疫调节作用,MD、HD组甘草酸可抑制胸腺细胞凋亡;HD组通过抗炎、抗氧化使肺脏指数接近对照组(
表1)。
3.4 LWE 对U损伤大鼠血清的影响
3.4.1 大鼠血清代谢谱图分析
如
图3所示,通过对空白组、模型组、阳性药组与不同剂量(高、中、低) LWE 给药组典型总离子流图(total ion chromatogram,TIC)对比显示,模型组与各剂量给药组呈现差异性。
3.4.2 代谢谱的多变量分析
基于XCMS-online平台,对各组大鼠血清样本进行代谢谱分析,采用OPLS-DA和PCA进行多维统计分析,结果如
图4所示。OPLS-DA模型中各组样本数据呈现显著聚类特征,模型组与空白组
${R}_{Y}^{2}$=0.989,
Q2=0.724,表明模型可靠,预测性良好。模型组与阳性药组及给药组均形成明显分离。PCA图显示空白组和模型组距离较远,提示U损伤对大鼠代谢影响明显,且MD组比AD更趋向于空白组,表明 LWE 对大鼠U损伤的代谢具有干预作用。基于PLS-DA模式输出的载荷图,筛选VIP>1 且
P<0.05的变量作为差异性代谢物,与NIST2017数据库比较,最终鉴定出如
表2所示15个与大鼠U损伤相关的差异性代谢物,提示 LWE 对U致大鼠损伤有代谢干预作用。
3.4.3 代谢通路分析
为进一步分析 GC-MS 多元统计分析得到的差异性代谢物的潜在信息,利用寻找到的血清中15 个差异性代谢物进行通路分析,根据Impact值大小选定与差异性代谢物相关性最大的4条代谢通路,如
图5所示4条代谢通路为甘氨酸-丝氨酸-苏氨酸代谢,乙醛酸及二羧酸代谢,缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸生物合成,不饱和脂肪酸代谢。
4 结论
代谢途径分析结果表明,甘氨酸-丝氨酸-苏氨酸代谢轴与LWE治疗铀损伤的关系最为密切。该通路通过调节机体能量代谢、抗氧化平衡和免疫功能,参与对抗铀诱导的多器官毒性
[15]。丝氨酸是一碳单位的主要来源,在丝氨酸羟甲基转移酶(serine hydroxymethyltransferase,SHMT)催化下可逆转化为甘氨酸,并生成四氢叶酸(tetrahydrofolic acid, THF),进而驱动一碳代谢
[15]。一碳单位通过THF传递,参与嘌呤等核苷酸的合成,为细胞增殖和组织修复提供物质基础。甘氨酸不仅是蛋白质合成的组成部分,还直接参与谷胱甘肽(glutathione,GSH)的合成
[16]。GSH是细胞内重要的抗氧化剂,能够清除铀暴露产生的过量活性氧,减轻氧化应激对肾脏、肝脏等靶器官的损伤
[16]。此外,甘氨酸与精氨酸在甘氨酸氨基转移酶作用下可产生胍乙酸,进而合成肌酸,为组织修复提供能量支持
[17]。苏氨酸作为人体必需氨基酸,直接影响免疫球蛋白的合成以及T淋巴细胞和B淋巴细胞的生成
[18]。本研究通过提升苏氨酸水平,可能增强淋巴细胞功能,改善机体免疫力。
首次基于GC-MS代谢组学阐明LWE修复U损伤的核心机制:通过调控缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸生物合成、不饱和脂肪酸代谢等通路,改善氨基酸、脂质及能量代谢紊乱,从而多靶点保护器官功能。LWE的剂量依赖效应进一步支持其作为潜在补充或替代疗法的价值。为中药干预放射性损伤提供了“代谢重塑”新视角,推动经验性用药向机制明确的多靶点治疗转化。
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