原发性肝癌在全世界最常见癌症中排第六位,在癌症死亡原因中排第三位
[1], 由于恶性程度高,起病隐匿,大多数患者在中晚期被诊断,从而失去了最佳的治疗机会
[2]。传统疗法手术、介入治疗、放疗和化疗等对晚期肝癌治疗效果差,近些年前沿交叉学科也为肝癌治疗注入革命性驱动力,如以纳米技术展示出良好的治疗潜力
[3],随着分子信号途径和免疫检查点的发现,分子靶向药物治疗和免疫检查点抑制剂的应用使晚期肝癌患者生存期较前有所延长,IMbrave150全球多中心Ⅲ期研究结果显示:阿替利珠单克隆抗体联合贝伐珠单克隆抗体的中位生存时间和无进展生存期较索拉非尼组均有明显延长,死亡风险降低34%,疾病进展风险降低35%。成为目前晚期肝癌患者一线治疗的首选
[4],但晚期肝癌总生存期仍低下,开拓新的治疗方法迫在眉睫,近几年,中国传统蒙药在肝细胞癌中的治疗受到了广泛关注。
蒙药阿拉嘎-斑布是斑蝥的干燥虫体,其药效成分为斑蝥素(cantharidin,CTD)具有抗癌活性,对恶性肿瘤尤其是晚期癌症有较好的治疗效果,如治疗肝癌、胃癌等
[5-6]。斑蝥素在抑制肿瘤细胞的同时对机体有提高免疫的功能,这是其作为抗癌药物突出的特点
[7],已有研究
[8-9]显示,它可通过影响细胞周期、细胞凋亡、细胞自噬等过程而发挥抗肿瘤的作用,但具体机制尚未完全清楚,对斑蝥素抗肿瘤作用机制的研究还需深入。现从侵袭、迁移的角度探索斑蝥素抑制肝细胞癌的作用机制,以期为斑蝥素多靶点多角度抗肿瘤机制的阐明提供一定的实验数据和理论参考。
1 材料与方法
1.1 研究对象
人肝癌细胞HepG-2和SMMC-7721细胞购于中国科学院细胞库,冻存于实验室液氮罐中。
1.2 药物及试剂
PI3K抑制剂LY294002购于MCE(货号:HY10108),p-Akt (货号:AF0016)、Akt (货号:AF6261)抗体购于美国Affinity公司,PI3K(货号:bs-2067R)、p-PI3K(货号:bs-5570R)抗体购于北京博奥森公司,MMP-9 (货号:ab76003)、MMP-2 (货号:ab92536)抗体购于英国 Abcam公司。
1.3 实验分组及给药
设置CTD多浓度药物组:0(对照组)、5、10、20、40、80、160、320 μmol/L,通过CCK-8实验检测并计算药物IC50,根据IC50值(半数抑制浓度)将第一部分CTD药物浓度设置为低(5 μmol/L)、中(10 μmol/L)、高(20 μmol/L)3个浓度梯度;第二部分实验分组:以PI3K/Akt通路为基础,实验分组为:Control组(含基本培养基和细胞)、CTD组(含基本培养基、细胞、CTD浓度10 μmol/L)、PI3K抑制剂LY294002组(含基本培养基、细胞、LY294002浓度20 μmol/L)、CTD+LY294002组(含基本培养基、细胞、CTD浓度10 μmol/L、LY294002浓度20 μmol/L)。
1.4 CCK-8实验
取对数生长期的细胞铺入96孔板,均有3个副孔,按照实验设计每孔加入100 μL含不同浓度CTD的基础培养基,并设置空白组只有基础培养基和对照组;分别在24、48和72 h,加入了CCK-8溶液,孵育3 h。酶标仪在450 nm处测定吸光度值;并计算增殖抑制率。
1.5 细胞划痕实验
在6孔板中每孔接种细胞密度约5×105个/mL,培养直至长满;用200 μL的灭菌枪头,在六孔板中画出笔直均匀的划痕间隙,镜下观察;D-PBS 清洗2~3遍,加入含2%血清的培养基,再分别加入高、中、低浓度的斑蝥素,继续培养48 h,在100倍镜下观察并拍照。
1.6 细胞侵袭实验
基质胶和无血清培养基稀释后铺入上室,下室注入500 μL含10% FBS完全培养基,上室每孔加入200 μL细胞悬液,约5×104个细胞/孔,分别加入高、中、低不同浓度斑蝥素,并设置空白组。24 h后固定、染色、清洗、晾干,在100显微镜下随机选取3个视野观察细胞并计数。
1.7 Western Blot实验
收集分组培养48 h后的细胞, 加入RIPA裂解液提取总蛋白, BCA法测蛋白浓度,常规电泳、转膜、封闭后一抗[GAPDH (1∶5 000),Akt 、p-Akt (1∶500), MMP-2、MMP-9 (1∶500), PI3K、p-PI3K 1∶1 000]4 ℃ 过夜,二抗避光孵育后上机扫描条带并分析灰度值。目的蛋白/GAPDH 代表蛋白的表达水平,每个样本重复3次。
1.8 统计分析
数据经SPSS 26.0软件处理,应用GraphPad Prism 9.0统计软件进行作图,数据符合正态分布以均数±标准差($\stackrel{-}{x}$±s)表示,多组间比较采用单因素方差分析;数据不符合正态分布时,多组间比较采用非参数Kruskal-Wallis分析,以P<0.05表示差异有统计学意义。
2 实验结果
2.1 第一部分实验结果
2.1.1 CCK-8实验结果
图1结果表明,按照实验分组,将0、5、10、20、40、80、160、320 μmol/L浓度的CTD分别作用于HepG-2和SMMC-7721细胞24、48、72 h后,与对照组比较,CTD对肝癌细胞HepG-2和SMMC-7721的抑制呈浓度、时间依赖性,且差异具有统计学意义(
P<0.05)。
因斑蝥素对两株肝癌细胞48 h抑制率较24 h明显增加,但与72 h抑制率差距不大,结合48 h的IC50值和细胞形态改变,选择5 μmol/L(低浓度)、10 μmol/L(中浓度)、20 μmol/L(高浓度)的CTD为给药浓度,进一步用于后续实验。实验时间除细胞侵袭实验设置为24 h外,余实验时间均设置为48 h。
2.1.2 细胞划痕实验结果
高、中、低不同浓度CTD药物组作用于两组细胞,与对照组(0 μmol/L)比较,SMMC-7721细胞低浓度组迁移率小于对照组,但差异无显著性(
P>0.5);而中、高浓度组与对照组比较,细胞迁移率均小于对照组,差异具有显著性(
P<0.05)。斑蝥素高、中、低浓度药物组对HepG-2细胞迁移均有抑制作用,且药物浓度越大,细胞迁移率越小,差异具有显著性(
P<0.05),如
图2所示。
2.1.3 细胞侵袭实验结果
高、中、低不同浓度CTD处理HepG-2及SMMC-7721细胞24 h,并设置对照组(0 μmol/L)。通过Image J软件统计各小室的细胞侵袭数量,与对照孔比较,随着斑蝥素组浓度的增加,穿过Transwell小室基底膜的两种细胞数逐渐减少,差异有统计学意义(
P<0.05),结果如
图3所示。
2.1.4 Western Blot实验结果
基于前期实验CCK-8实验、细胞侵袭和细胞划痕实验所示,斑蝥素对HepG-2细胞的增殖、侵袭、迁移抑制能力较SMMC-7721细胞更强,故选取HepG-2细胞进行Western Blot实验初步探索其作用机制。结果所示:与对照组(0 μmol/L)比较,蛋白MMP-9、MMP-2表达下调;且斑蝥素浓度越高,蛋白表达差异越明显;差异均有显著性(
P<0.05)。结果如
图4所示。
2.2 第二部分实验结果
2.2.1 CCK-8实验结果
结合第一部分实验结果所示,选取斑蝥素作用于两株肝癌细胞48 h后进行CCK-8法检测,结果表明(
图5):与对照组相比,CTD组、LY294002组、CTD+LY294002组均可以抑制细胞增殖,且差异具有显著性(
P<0.05);联合用药组抑制细胞增殖能力较同浓度单药组增强,差异均统计学意义(
P<0.05)。
2.2.2 细胞划痕实验结果
按照实验分组给药处理HepG-2及SMMC-7721细胞48 h,实验结果表明,与对照组比较,各实验组细胞的迁移面积均减小,联合用药组抑制迁移能力较同浓度单药组效果增强,按照愈合面积计算并统计,差异具有显著性(
P<0.05)。如
图6所示。
2.2.3 细胞侵袭实验
按照实验分组处理HepG-2及SMMC-7721细胞24 h,与对照组相比,各实验组穿过Transwell小室基底膜的细胞数逐渐减少,两药联合应用抑制侵袭能力较同浓度单药组增强,差异有统计学意义(
P<0.05),结果如
图7所示。
2.2.4 Western Blot实验
按照实验分组作用于肝癌细胞HepG-2 48 h后,与对照组比较,蛋白MMP-9、MMP-2表达下调,p-PI3K、p-Akt表达下调,且联合用药组比同浓度单药组蛋白表达差异更明显,差异具有统计学意义(
P<0.05)。结果如
图8所示。
3 讨论
斑蝥素是一种从斑蝥中提取的天然化合物,在蒙医药中称之为阿拉嘎-斑布,具有显著的抗肿瘤活性。在癌症中,已有的基础研究
[10-11]显示,它可通过抑制细胞自噬、凋亡等过程而发挥抗肿瘤的作用,但具体机制未完全清楚,对斑蝥素抗肿瘤作用机制的研究尚需深入,从侵袭、迁移角度探讨斑蝥素抗肝癌细胞的作用的研究机制目前未见有公开报道。
PI3K/Akt 信号通路与许多疾病的发生和发展密切相关,如癌症、糖尿病、心血管疾病等。PI3K 根据它的结构与底物结合不同可分为 I、II、III 三类。研究发现,I 型与肿瘤密切相关
[12], I 型 PI3K 磷酸化 3、4-二磷酸磷脂酰肌醇(PIP2),产生 3、4、5 三磷酸磷脂酰肌醇(PIP3)
[13]。 Akt是 PI3K 下游效应分子中主要的一类,Akt 与 PIP3 相结合后,Akt 的 473 位丝氨酸位点(Ser473)或第 307 位苏氨酸位点(Thr307)发生磷酸化,激活下游作用底物,从而促进肿瘤细胞的增殖和侵袭
[14]。
斑蝥素能抑制肝癌细胞的增殖、侵袭和迁移,且呈时间、浓度依赖性,斑蝥素对HepG-2细胞的抑制作用强于SMMC-7721细胞。采用Western Blot方法检测低、中、高浓度的CTD作用于肝癌细胞HepG-2 48h后,MMP-2和MMP-9蛋白的表达情况,结果显示,随着CTD药物浓度的增加,MMP-9和MMP-2均表达下调,且呈浓度依赖性。为了进一步明确其作用机制,查阅文献发现CTD可以抑制PI3K/Akt通路
[15-16],也有研究表明,PI3K/Akt信号通路可以通过激活MMP-2和MMP-9促进肿瘤细胞的侵袭、迁移
[17-18]。所以在第二部分以PI3K/Akt通路为基础,将实验分为Control组、CTD组、PI3K抑制剂LY294002组、CTD+LY2940020组,结果显示,与对照组比较,CTD与PI3K抑制剂LY294002对肝癌细胞存在相同的抑制作用,当两种药物单独或联合作用于肝癌细胞后,p-PI3K、p-Akt、MMP-2和MMP-9的表达均下调,与对照组比较,两药联合使用较同浓度单药组蛋白表达差异更显著,且差异有统计学意义(
P<0.05)。
4 结论
斑蝥素可以抑制人肝癌细胞的增殖、侵袭、迁移,CTD和LY294002药物单独或联合作用于肝癌细胞后,蛋白p-PI3K、p-Akt、MMP-2、MMP-9表达均下调,两药联合使用后,上述蛋白与对照组表达差异最明显,证明斑蝥素与PI3K抑制剂存在共同的作用机制,推测CTD可以通过PI3K/Akt通路抑制细胞的侵袭和转移。
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