全球盐碱化土壤面积达9.55亿h{m
2}^{[
1]},分布在全球100多个国家。盐碱化土壤是指土壤中含有过量的盐分和碱性物质,导致土壤结构恶化、肥力下降的一种现象
[2]。土壤中的盐分积累主要来源于含有微量NaCl的灌溉水和海水。土壤盐浓度的增加降低了植物吸收水分的能力,一旦Na
+和Cl
-被根系大量吸收,Na
+和Cl
-都会通过降低代谢过程、光合效率等而对植物生长产生负面影响
[3]。在全球气候变化和人类活动的影响下,盐碱化土壤的面积逐年扩大,对农业生产、生态环境和人类社会造成了严重影响
[4],是影响全球农业发展的重要问题。微生物在土壤养分流动和植物生长中起着关键作用。土壤微生物既能分解有机物,又能通过自身的活动作为土壤酶和养分的主要来源,因此土壤微生物对土壤和植物的许多重要过程和功能有很大的影响
[5]。
植物根际促生菌(plant growth-promoting rhizo-bacteria,PGPR)指一类可以在植物根系周围的土壤中生长、发育和繁殖,通过在根际附近分泌的各种代谢物质,能够加快植株生长发育、抑制土壤病原微生物的有益微生物
[6]。研究表明,PGPR可以通过增磷、固氮和产生吲哚-3-乙酸(IAA)、氨基环丙烷-1-羧酸脱氨酶(ACC)等作用,直接或间接缓解植物的非生物胁迫,可在植物种子及其根际附近稳定且有效地定殖,还可以显著减少青枯病菌等植物病原微生物的数目,促进植物生长,改善植物根际土壤
[7-8]。在此过程中,PGPR拮抗病原菌的主要方式为分泌抑菌物质和养分竞争
[9]。其中巨大芽孢杆菌(
Bacillus megaterium)能够提高植株抗病能力
[10],增加土壤养分含量,促进植物生长,常被用于农业生产中制造生物有机肥
[11]。现以高粱为试材,探究巨大芽孢杆菌对盐胁迫下高粱种子萌发及幼苗生理特性的影响,揭示巨大芽孢杆菌缓解其盐胁迫适应机制,以期为盐碱地建植高粱、提高盐碱地资源利用效率提供技术支持。
1 材料与方法
1.1 材料
使用巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)L322B01,菌株源自山东昌邑北部盐田复垦地。高粱品种为京都铁杆100,购自当地种子市场。
1.2 方法
1.2.1 菌悬液的制备
准备LB(lysogeny broth)液体培养基,接种巨大芽孢杆菌L322B01,于30.0 ℃、180 r/min的条件下摇床培养24 h,将菌悬液转移至离心管中7 000 r/min离心8 min。弃上清液,菌体细胞用20 mL蒸馏水洗涤两次,7 000 r/min离心8 min。弃上清,菌体用蒸馏水调节至OD600(optical density)数值为1的菌悬液,备用。
1.2.2 种子处理
选取700粒大小相同、颗粒丰满的高粱种子,采用赵忠娟等
[12]种子萌发测定方法,得到无菌高粱种子。将其放置于菌悬液浸泡,对照组使用去离子水浸泡,并于黑暗处、室温下培养24 h,分别放置于各含有200 mmol/L NaCl溶液与无菌水的平板(内部盖有2张滤纸)中培养,每组各3次重复,26 ℃恒温培养。
设置4个处理:去离子水浸泡过的种子,转移到含有无菌水的平板上,作为对照组(S0),转移到含有200 mmol/L NaCl溶液的平板上,作为加盐组,标记为S200;加菌组为使用菌悬液浸泡后的高粱种子,转移到含有无菌水的平板上,标记为J0;加菌加盐组标记为J200。培养3 d后统计各平板中高粱种子的萌发数量,并计算出相应的萌发率。
1.2.3 幼苗处理
每40 g混合土壤(有机营养土、珍珠岩、蛭石质量比3∶1∶1)中分别加入80 mL去离子水、200 mmol/L NaCl溶液,搅拌均匀,准备10组,每组3次重复,并将每组处理后的土壤放入塑料杯中。培养3 d后,将生长情况相同且已萌发的高粱种子移入盛有土壤的塑料杯中,每杯种植10粒种子。于27 ℃,光照强度3 000 lux,培养15 d。培养期间,每2 d使用蒸馏水补充水分。7 d后,向每组经巨大芽孢杆菌处理后的种子所在土壤中加入3 mL菌悬液。培养15 d后,测定高粱幼苗的生物量及相关生理指标。
1.2.4 幼苗的生理生化指标测定
培养15 d后,将盐浓度条件下培养的高粱幼苗带根取出,统计每组幼苗的株数,测量并记录幼苗的株高与茎粗,称取每组幼苗的整株鲜重、地上部鲜重与根鲜重。称量后,将幼苗烘干取出,测得每组幼苗的整株干重、地上部干重与根干重。叶绿素、可溶性蛋白质和丙二醛(malonaldehyde, MDA)含量测定参照文献[
13]。
2 实验结果与分析
2.1 促生细菌对高粱种子萌发的影响
种子的发芽率在农业生产过程中是评判其经济价值与质量的一项重要指标,种子的萌发率可以较为直观地反映PGPR对高粱种子萌发的促生作用
[14]。PGPR能够缓解盐胁迫对种子发芽的抑制作用,增强种子对盐分的抗性
[15]。巨大芽孢杆菌对高粱种子平均萌发率的作用效果如
图1和
图2所示,结果显示,接种巨大芽孢杆菌的种子萌发数更多,芽长更长。由
图2可知,在无盐胁迫时,与对照组S0相比,J0中高粱种子的萌发率提高了7.78%;盐胁迫条件下的S200萌发率降低了15.56%;与S200相比,加盐加菌种组J200种子的萌发率提高了17.78%。
2.2 促生细菌对高粱幼苗的株数、株高与茎粗的影响
在不同盐胁迫条件下进行了盆栽实验,以探究促生细菌在盐渍化土壤中对高粱幼苗的促生效果。如
图3和
表1所示为促生细菌在不同盐胁迫条件下对高粱幼苗株数、株高与茎粗的影响。从
图3可以看出,同相应盐浓度下未接种促生细菌的高粱幼苗相比,接种促生细菌的幼苗长势明显更加旺盛,叶片面积大,生长株数多;未接种促生细菌的幼苗叶片尖端的萎蔫现象更加明显;在株数方面,S0平均长出了9.4棵,J0平均长出了9.4棵,S200平均长出了7.6棵,J200平均长出了9.0棵。
J0与S0相比,其促生作用并不显著,但当盐胁迫存在时,J200比S200长出的株数增多了18.42%。在株高方面,J0比S0增加了1.33%,J200比S200增加了17.37%。在茎粗方面,J0比S0增加了5.37%,J200比S200增加了3.43%。
2.3 促生细菌对高粱幼苗生物量的影响
促生细菌对高粱幼苗生物量的影响如
表2所示,在无盐胁迫条件下,接种促生细菌的高粱幼苗的整株鲜重提高了4.89%,地上部鲜重增加了12.73%,整株干重提升了4.29%,地上部干重增加了12.28%。在200 mmol/L盐胁迫下,根鲜重和干重均呈现下降趋势。与未接种菌剂的相比,接种促生细菌的幼苗整株鲜重、地上部鲜重、整株干重和地上部干重分别增加了17.89%、59.57%、18.98%和12.33%。
2.4 促生细菌对高粱幼苗叶绿素含量的影响
叶绿素(Chlorophyll)通常在水果、蔬菜等绿色植物的细胞中能够被发现,并在植物细胞中同糖类、脂质与蛋白质等物质结合构成细胞器——叶绿体
[16]。叶绿素是绿色植物进行光合作用时所需的重要光合色素,其含量既可体现植物的生长发育状况、新陈代谢水平及营养情况
[17],又是进行环境生理研究时所需参考的重要指标。
在高盐胁迫下,幼苗叶片中总叶绿素含量均呈减少的变化规律(
图4),S0和J0平均含叶绿素分别为0.193 mg/g和0.208 mg/g,S200和J200平均含叶绿素分别为0.140 mg/g和0.173 mg/g。在无盐胁迫时,接种促生菌剂的幼苗叶片中总叶绿素含量较未接种的增加了7.77%;在高盐浓度下,接种菌剂的幼苗叶片中总叶绿素含量增加了23.57%。
2.5 促生细菌对高粱幼苗可溶性蛋白质含量的影响
植物体中的可溶性蛋白(soluble protein, SP)主要为催化多种生物体内新陈代谢反应的酶,其含量的多少可以体现出植物的整体代谢
[18]。可溶性蛋白能够增加植物细胞内部的渗透压,保持细胞内较高的渗透势,减少水分向细胞外散失,保护植物细胞,缓解盐胁迫对细胞的造成的损伤。
高盐胁迫下,高粱幼苗可溶性蛋白含量均呈下降的趋势(
图5),其中S0、J0、S200、J200平均SP含量分别为15.3 、20.98 、9.97 、13.54 mg/g。当盐浓度为0时,同未接种促生细菌的幼苗相比,接种有促生细菌的幼苗叶片中SP含量增加了37.12%;在高盐浓度下,接种促生细菌的幼苗叶片中SP含量增加了35.81%,促生效果显著。
2.6 促生细菌对高粱幼苗丙二醛含量的影响
丙二醛常被作为反映胁迫危害程度的生理指标,故植物在衰老情况下或不利条件下生长发育时,MDA含量可以反映植物细胞膜的完整性
[19]。高盐胁迫条件下,无论是否接种有促生细菌,高粱幼苗的叶片中丙二醛的含量均呈现升高趋势(
图6)。其中S0、J0、S200、J200平均MDA含量分别为3.046、2.833、5.477、2.975 μmol/g FW(fresh weight,鲜重:样品在测定时新鲜状态下的重量)。当无盐胁迫时,与未接种促生细菌的高粱幼苗相比,接种促生细菌的幼苗叶片中丙二醛的含量减少了6.99%;在高盐胁迫下,接种促生细菌的幼苗叶片中丙二醛含量比未接种菌种的幼苗叶片减少了45.68%,防御效果显著。
3 讨论
盐碱地改良是全球农业面临的重大挑战,据联合国粮食及农业组织(Food and Agriculture Organization of the United Nations, FAO)统计,全球约7%的耕地受到盐渍化影响,导致农作物产量显著下降
[20]。在这一背景下,巨大芽孢杆菌作为一种有益微生物,在盐碱地改良中扮演着不可忽视的角色。盐胁迫是影响植物生长发育的重要因素之一。高盐浓度会引起渗透胁迫、离子毒害和活性氧(reactive oxygen species, ROS)过量产生等不利因素,影响植物细胞及其代谢过程。在某些条件下,植物通过向土壤分泌代谢物来吸引有益微生物在根际或根组织中定植,这些微生物可以提高植物对生物和非生物胁迫的适应性
[21]。
盐胁迫会对植株造成不可逆的氧化损伤,影响种子的萌发过程
[22]。研究表明,巨大芽孢杆菌能通过分泌生长素类物质,如吲哚乙酸(indoleacetic acid, IAA),促进种子萌发和根系发展
[23]。王新叶等
[24]从糯高粱叶片中分离筛选出4株具备产IAA的能力(1.43~2.56 mol/L)的枯草芽孢杆菌,并通过实验验证其对糯高粱种子萌发具有显著的促进作用,其中HY1-1促生长能力最强,可使糯高粱的株高显著提高29.17% 。实验数据显示L322B01对高粱种子的萌发及出芽起到显著的积极作用。在0~200 mmol/L的NaCl浓度范围内,接种巨大芽孢杆菌的高粱幼苗在株高、茎粗和生物量等方面均表现出比未接种幼苗更好的生长状况。接种促生菌
Metabacillus dongyingensis sp. nov. BY2G20 的玉米在100 mmol/L盐胁迫下,幼苗的生理株高、根长和鲜重分别增加了 37.9% 、19.7% 和 37.1%
[25],与本文研究的结果一致。可能是因为盐胁迫条件下巨大芽孢杆菌能够改善植物的营养状况,促进高粱的根系中相关生物物质的合成以及对水盐等养料的吸收和利用,从而促进根部的生长发育;同时也能表明,盐胁迫会抑制高粱根部的相关生物量合成与积累,从而抑制幼苗的生长。
盐胁迫会抑制高粱幼苗体内叶绿素的净合成与可溶性蛋白质的积累,随着盐浓度的增大,抑制现象愈加明显;而巨大芽孢杆菌的尽管无法完全消除盐胁迫带来的这一不利影响,但会在一定程度上缓解盐胁迫的负面影响。通过促进高粱幼苗体内叶绿素的积累(
图4)和可溶性蛋白的合成(
图6),使细胞内具有较高的渗透压,故能削弱盐胁迫损害植物细胞的过程,进一步激活高粱应对盐胁迫的抗性系统。接种巨大芽孢杆菌能促进了紫花苜蓿幼苗根和芽的生长,提高紫花苜蓿叶片内叶绿素含量、可溶性蛋白含量以及抗氧化酶活性,降低丙二醛的含量,显著提升土壤脲酶、蔗糖酶、蛋白酶、过氧化氢酶的活性,有效缓解盐胁迫对紫花苜蓿的危害,促进紫花苜蓿的生长
[26];Ji等
[27]采用黄河三角洲麦田土壤将接种贝莱斯芽孢杆菌JC-K3的小麦进行盆栽实验,结果显示与对照组相比可溶性糖含量提高了58.86%,叶绿素a含量与未接种的小麦相比增加了17.00%。叶绿素是植物进行光合作用的关键色素,光合作用是植物能量和有机物质生产的基础,叶绿素含量的增加提升了光合作用的效率,意味着更多的光能被转化为化学能,进而促进植物的生长和发育
[28]。
细胞内丙二醛(MDA)的含量增加,导致细胞膜结构被破坏,离子交换失衡,胞外大量的Na
+、Cl
-进入细胞内,盐离子在胞内累积会降低细胞对Ca
2+、K
+、N、P等营养要素的吸收利用,进而影响植株的正常生物学功能
[20]。Wang等
[29]研究发现通过三种植物促生长根际杆菌菌株 (蜡样芽孢杆菌AR156、枯草芽孢杆菌SM21和沙雷氏菌XY21)组成的菌剂使甜椒叶片MDA含量降低了40%。本文研究发现促生细菌在任何盐度下均可有效减少高粱幼苗叶片中丙二醛的含量,说明菌剂通过降低植物细胞中丙二醛的含量,保护生物膜完整不受损,促进高粱幼苗的生长发育;在本实验中为对抗高盐浓度的损伤,丙二醛的含量升高,促生细菌可以显著降低其含量,起到防护作用。
巨大芽孢杆菌能通过分泌如ACC脱氨酶(1-氨基环丙烷-1-羧酸脱氨酶)等植物生长调节物质和酶来增强植物的耐盐性
[19],该酶可将用于逆境乙烯合成的直接前体物质ACC分解为氨和α-丁酮酸,以提高植物对逆境的适应能力,减轻甚至抵消盐胁迫的影响,促进植物根系生长和根系分泌物的产生,进而改善土壤结构和提升土壤肥力。ACC脱氨酶是诱导植物耐盐胁迫的最有效机制之一,研究表明,从巨大芽孢杆菌中克隆出的
acds基因(编码ACC脱氨酶)并构建超表达载体,转入烟草细胞后,转基因烟草的耐盐性明显增强
[30]。研究发现枯草芽孢杆菌可以产生ACC脱氨酶,并对大麦具有良好的促进效果
[31],与本文研究结果一致。
综上所述,巨大芽孢杆菌的添加对于盐碱地的植被和生态恢复具有重要意义,不仅增强了植物的抗逆性,还通过提高光合作用效率,进一步促进了植物的生长,其应用对于提高农业产量和可持续性至关重要。研究结果为利用巨大芽孢杆菌作为生物肥料,提高作物在盐渍化土壤中的生产能力提供了科学依据。
4 结论
(1)巨大芽孢杆菌L322B01菌剂对高盐胁迫下高粱种子的萌发及出芽起到显著的积极作用,种子萌发率提高了17.78%。
(2)在高盐胁迫下,巨大芽孢杆菌菌剂使高粱幼苗叶绿素含量提高了23.57%,光合作用效率增强,地上部分生物量的合成增加(P<0.05),可溶性蛋白增加了35.81%,丙二醛含量减少了45.68%,从而促进了高粱幼苗对盐胁迫的耐受能力。
(3)接种促生菌剂不能完全消除高盐胁迫对高粱幼苗的抑制作用,但可以减缓盐胁迫对高粱幼苗生长造成的危害。
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