输卵管妊娠(tubal ectopic pregnancy,TEP)是异位妊娠(ectopic pregnancy,EP)中常见的类型
[1]。TEP约占所有妊娠的2%,其死亡率占所有妊娠相关死亡率的4%
[2-3]。目前TEP的治疗包括期待治疗、药物治疗和手术治疗
[4],甲氨蝶呤(methotrexate,MTX)单剂量或多剂量方案是主要的药物治疗方案
[5-6],但研究发现约37%女性用药后可能出现胃肠道不适、发热、头痛、肝肾毒性甚至骨髓抑制等多种不良反应
[7-8]。因此,寻找可兼顾有效性及安全性的TEP治疗方法尤为重要。
化瘀消癥颗粒(Huayu Xiaozheng Granules,HXG)是由邓高丕教授团队在20余年TEP综合治疗的研究基础上开发的一种中药颗粒制剂,由丹参、赤芍、桃仁、天花粉、紫草5种中药组成,自2017年3月26日起作为院内制剂在广州中医药大学第一附属医院投入临床使用。研究团队前期已运用超高效液相色谱-串联质谱联用仪(ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry,UPLC-MS/MS)对上述5种中药的化学成分进行了鉴定
[9]。前期临床试验和基础实验已证实HXG对早期TEP的疗效确切
[10],然而,其在早期TEP中的潜在机制尚不明确。
与宫内妊娠相似,TEP中胚胎着床经过包括定位、黏附和侵入3个步骤
[11]。Talin1是一种位于细胞-基质附着位点的黏附复合体蛋白,在各种器官及组织中普遍表达,是细胞增殖、黏附、迁移和侵袭所必需的蛋白
[12]。研究表明,踝蛋白1Talin1被Ras相关蛋白1(Ras-associated protein 1,Rap1)及其效应物(Rap1-interacting adaptor molecule,RIAM)募集到细胞膜上,与RIAM结合后被激活
[13]。在妇科领域,有学者认为Talin1参与子宫内膜异位症、子宫腺肌症和反复种植失败的发病机制
[14-16]。本研究团队前期研究发现,Talin1在输卵管妊娠患者的输卵管组织及绒毛中高表达,HXG下调人绒毛膜滋养层细胞(HTR-8/SVneo human trophoblast cell,HTR-8/SVneo)中Talin1及其下游通路蛋白整合素β3(integrin subunit beta 3,integrinβ3)的表达
[17-18]。因此,探讨HXG对于输卵管上皮细胞黏附的影响以及Rap1/Talin1/integrinβ3信号通路的表达变化,以期为HXG对TEP的治疗提供新的依据。
1 材料与方法
1.1 实验动物
24只雌性SD大鼠(SPF级),体质量180~200 g,购自广东省医学实验动物中心。动物许可证号:SCXK(粤)2022-0002。所有动物均于广州中医药大学第一附属医院SPF级动物房饲养,许可证号:SYXK(粤)2018-0034。大鼠4只一笼,常规饲料喂养,自由进食水,保持空气流通,每日正常光照,控制室温22~26 ℃,相对湿度45%~60%,适应性饲养5 d后供实验用。本研究经广州中医药大学第一附属医院实验动物伦理委员会批准,批件号:GZTCMF1-20230604。
1.2 实验药物与试剂
化瘀消癥颗粒(粤药制字Z20170001),规格:7 g/袋,药物组成(合生药量):丹参(0.357 g/g)、赤芍(0.357 g/g)、桃仁(0.357 g/g)、紫草(0.357 g/g)、天花粉(0.476 g/g),购自广州中医药大学第一附属医院。
甲氨蝶呤(MTX)注射液(批号:EA5230),规格:10 mL:1 000 mg,Pfizer (Perth) Pty Limited。RPMI-1640培养基、胰酶购于美国Gibco公司(货号:C118075500CP、25200-056),反转录试剂盒、Maxima SYBR Green/ROX qPCR Master Mix (2×)、Lipofectamine 3000转染试剂盒购于美国Thermo Fisher Scientific公司(货号:4368813、K0223、K0221),Talin1(货号:4021S)、E-cadherin(货号:3195)、β-catenin(货号:9562)、p120ctn(货号:59854)、ICAM-1(货号:4915)、Krt(货号:4545)、Integrinβ3(货号:13166)抗体购于美国CST公司,Pallixin(货号:ab230361)、β-TubulinDNAH5抗体、Rap1GAP(货号:ab230361)、GAPDH(货号:ab8245)购于英国Abcam公司,辣根酶标记山羊抗兔IgG、辣根酶标记山羊抗鼠IgG购于美国KPL公司(货号:AB-2313567、AB-10015289)。DNAH5抗体、F-actin抗体(货号:ab234826、ab205)购于英国Abcam公司,RSPH9抗体(货号:23253-1-AP、28443-1-AP)购于武汉三鹰公司。DAPI(货号:H-1200)购于美国VECTOR公司。CCK-8试剂盒(货号:C0037)购于碧云天公司。
1.3 仪器
CO48R-230型CO2培养箱(英国New Brunswick Scientific公司);LAD-LCJT-1B型超净工作台(东莞美维净化设备有限公司);SKG-01电热恒温干燥箱(湖北省黄石市医疗器械厂);Step One QPCR仪(美国Applied Biosystems公司);534138型倒置荧光显微镜(日本Nikon EclipseTi-s);T4-203-0498型自动细胞计数仪(美国Cellometer公司);常温离心机(型号SC-3610)、高速冷冻离心机(型号HC-2062),科大创新股份有限公司中佳分公司;1645050型电泳仪、1704150型转膜仪(美国Bio-Rad公司);FC型酶标仪(美国Thermo公司,型号Multiskan FC)。
1.4 组织标本
收集2023年2月1日—2023年5月31日于广州中医药大学第一附属医院妇科,因子宫肌瘤、子宫腺肌症或自愿输卵管切除而行子宫切除及双侧输卵管切除术的患者输卵管组织标本。本研究经广州中医药大学第一附属医院伦理委员会批件,批件号:K-2021-116,所有纳入的患者均签署知情同意书。
1.5 HXG含药血清制备
24只雌性SD大鼠随机分为2组(每组12只)。HXG组大鼠每天灌胃(8.4 g/kg),对照组大鼠连续7 d灌胃生理盐水(剂量:1 mL/100 g)。第7天,给药1 h后无菌环境下腹主动脉采血,分离血清样品56 ℃水浴灭活30 min,过滤后-20 ℃保存,用于后续细胞实验。
1.6 细胞培养
人输卵管组织放入DMEM液中,低温条件下1 h内运回实验室,无菌条件下剖开输卵管,暴露黏膜面,清洗血污,弯头剪剪下黏膜,大小约1 mm×1 mm×1 mm,加入I型胶原酶,37 ℃温箱消化1 h,中间震荡数次,取出后反复吹打使呈浑浊的细胞悬液,转移至离心管中,800 r/min离心10 min,吸除上清液,在细胞沉淀中加入Han’s F12培养液,反复吹打使细胞分散,然后转移至培养瓶中,放入5%CO2,37 ℃培养箱培养。
1.7 质粒转染
将ov-Talin1转染至输卵管上皮细胞,所有转染步骤参照Lipofectamine 3000转染试剂说明书进行。
1.8 CCK-8
100 μL细胞悬液(2×104个/孔)接种于96孔板,分为Control组、MTX组、5% HXG含药血清组、10% HXG含药血清组、15% HXG含药血清组。分别培养24、48 h,培养结束后,加入CCK-8(10 μL/孔)试剂。孵育2 h后用酶标仪检测各孔在450 nm波长处的吸光度(OD)。所有实验均重复进行3次。
1.9 细胞黏附试验
单细胞悬液(5×105个/孔)接种于96孔板中,分为Control组、ov-Talin1组、ov-Talin1+MTX组和ov-Talin1+HXG组,在37 ℃、5% CO2培养箱中培养4 h。PBS洗涤2次,用0.5%结晶紫溶液对贴壁细胞染色30 min。再次使用PBS洗去未着色的多余染料3次。在每个孔中加入0.5 mL 2%十二烷基磺酸钠(SDS),溶解细胞并释放与细胞核结合的染料。用酶标仪测定溶液在570nm波长处的OD值。
1.10 免疫荧光染色
盖玻片上生长的细胞用4%多聚甲醛在4 ℃固定30 min,用PBST(含0.5% Triton X-100)洗涤3次,阻断液(含3% BSA的PBST)室温孵育20 min,再用抗DNAH5、抗RSPH9、抗F-actin和抗FOXJ1 抗体室温孵育1 h。取一抗反应液,加入1×PBS浸泡载玻片3次,每次5 min。加入荧光二抗(1∶100),室温湿箱孵育1 h,避光。用吸水纸除去二抗反应液,用1×PBS浸泡载玻片。在室温下每孔加入DAPI 5 min使细胞核化,再用1×PBS洗涤多余的DAPI。使用抗荧光封片剂(含DAPI)的封闭液进行封片,在荧光显微镜下观察并采集图像。
1.11 实时荧光定量PCR
TRIzol试剂提取细胞总RNA,按试剂盒说明书反转录合成cDNA。以cDNA为模板,在ABI Step One QPCR 仪器上进行QPCR。以GAPDH作为内部参数,根据2
-ΔΔCt计算方法对相对mRNA表达水平进行归一化。引物序列如
表1所示。
1.12 Western blot实验
用RIPA裂解液冰上匀浆裂解,离心后收取上清液并测浓度。蛋白样本量为20 μg,电泳后转移至经甲基乙醇活化的PVDF膜上,室温下用5% BSA封闭1 h。将含有待测蛋白的膜与用抗体稀释液制备的相应一抗(包括E-cadherin、β-catenin、p120ctn、ICAM-1、KRT、Pallixin、β-Tubulin、Talin1、Rap1GAP、Integrinβ3)在室温下孵育2 h。二抗(山羊抗鼠稀释比例1∶10 000,山羊抗兔稀释比例1∶10 000)室温结合1.5 h,使用红外荧光成像系统检测蛋白印迹,将Image J软件检测到的各蛋白条带的灰度值与内部参考蛋白的灰度值进行归一化。
1.13 统计学处理
统计学处理采用SPSS 26.0软件进行分析。两组间的数据比较,符合正态分布的采用t检验,方差不均采用Welch校正,不符合正态分布采用Mann-Witney U检验。多组间的数据比较,符合正态分布采用参数检验,方差齐性者采用单因素方差分析,方差不齐者采用韦尔奇方差分析,不符合正态分布采用Kruskal-Wallis 检验,以P<0.05为差异有统计学意义,并采用GraphPad Prism 10.0绘制统计图。
2 结果
2.1 ov-Talin1细胞系的构建
CCK-8检测结果表明,与对照组相比,所有HXG组和MTX组输卵管上皮细胞的增殖能力均明显减弱,差异具有统计学意义(
P<0.000 1)。且10% HXG组与5% HXG组、15%HXG组相比,具有更强的抑制作用(
P<0.01,
P<0.05)。因此,10%被选为最佳浓度,如
图1(a)所示。为探索Talin1在TEP中的生物学作用,通过质粒转染建立ov-Talin1细胞系,并运用QPCR和Western blot验证转染的效率,如
图1(b)、
图1(c)所示。
2.2 HXG抑制ov-Talin1细胞黏附
采用细胞黏附实验研究HXG对ov-Talin1细胞黏附能力的抑制作用。结果表明,与对照组相比,过表达Talin1提高了输卵管上皮细胞的黏附能力(
P<0.05)。经HXG处理后,ov-Talin1细胞的黏附能力明显受到抑制(
P<0.05),如
图2(a)所示。同时,检测黏附相关蛋白E-cadherin、β-catenin、120 catenin(p120ctn)和ICAM-1的表达,Western blot结果显示,ov-Talin1细胞中E-cadherin的表达量减少(
P<0.000 1),而HXG和MTX可增加其表达量(
P<0.001),且HXG比MTX的提高作用更显著(
P<0.000 1)。β-catenin、p120ctn和ICAM-1在ov-Talin1细胞中均有所增加(
P<0.000 1、
P<0.01、
P<0.000 1),而在MTX及HXG组中则明显减少,如
图2(b)、
图2(c)所示。
2.3 HXG下调ov-Talin1细胞的纤毛功能相关蛋白
纤毛摆动和平滑肌收缩是胚胎运输至子宫的关键,并由相关蛋白驱动。因此,采用免疫荧光染色法检测纤毛运动蛋白的表达。结果显示,过表达Talin1可增加纤毛运动蛋白RSPH9、FOXJ1、F-actin的表达(
P<0.000 1、
P<0.01、
P<0.001),而HXG则显著降低DNAH5、RSPH9、FOXJ1、F-actin表达(
P<0.05、
P<0.000 1、
P<0.000 1、
P<0.001),如
图3所示。
2.4 HXG抑制细胞骨架蛋白的表达
QPCR检测结果显示:ov-Talin1可增加细胞骨架蛋白β-Tubulin、Paxillin、Krt的表达,而HXG显著降低其表达。由
图4(b)所示的Western blot检测提可知,与对照组比较,ov-Talin1组细胞骨架蛋白表达升高(
P<0.000 1),而HXG也显著降低其表达(
P<0.000 1)。
2.5 HXG抑制Rap1/talin1/integrinβ3信号通路的活性
为进一步探讨HXG治疗TEP的潜在信号通路,采用QPCR和Western blot检测包括Talin1、Rap1GAP和Integrinβ3在内的信号通路相关指标。结果表明,与对照组比较,运用HXG处理ov-Talin1细胞后,Talin1、Rap1GAP和Integrinβ3的表达均下调(
P<0.000 1),如
图5(b)、
图5(c)所示。
3 讨论
本研究团队前期临床研究及细胞实验已证实HXG治疗TEP的效果,并发现HXG可能通过抑制HTR-8/SVneo细胞的黏附、迁移和侵袭以治疗早期TEP,且近年来研究团队也不断探索其潜在的分子机制
[19-20]。
输卵管在TEP的发病机制中发挥着重要作用,其微环境的改变和功能障碍可导致异位胚胎的着床和植入
[21]。然而,HXG对TEP中对输卵管的疗效尚未确定。通过质粒转染建立了ov-Talin1细胞系,以探究Talin1在TEP中的作用。在TEP中,细胞黏附是植入和侵袭的第一步
[22]。研究表明,Talin1通过介导细胞黏附、迁移和侵袭与多种恶性肿瘤的进展密切相关,而这些特征与胚胎植入的细胞生理过程相似
[23]。
研究发现,ov-Talin1输卵管上皮细胞比正常细胞具有更强的黏附能力,而HXG可抑制其作用。此外,通过检测E-cadherin、β-catenin、120 catenin(p120ctn)和ICAM-1的表达发现,E-cadherin在ov-Talin1细胞中的表达减少,而在HXG的作用下,E-cadherin的表达增加。E-cadherin是一种调节细胞间相互作用的黏附分子
[24]。研究表明,E-cadherin的减少可导致输卵管上皮细胞排列松散,从而可能出现滋养层细胞入侵与输卵管上皮之间的错误交叉
[25]。ICAM-1是一种黏附受体,其最显著作用是调节白细胞从血液循环募集至炎症部位
[26]。β-catenin分子与钙粘蛋白的细胞质结构域紧密结合,通过α-catenin将钙粘蛋白与肌动蛋白细胞骨架相连接,从而在钙粘蛋白的结构组织和功能方面发挥重要作用
[27-28]。炎症输卵管中β-catenin的表达增强可能是导致EP的易感因素之一
[29]。p120ctn在细胞间连接和细胞内信号转导中发挥关键作用
[30]。ov-Talin1细胞中β-catenin、p120ctn和ICAM-1表达均增高,而HXG组则明显降低,表明HXG从分子角度抑制了输卵管上皮细胞的细胞黏附。
细胞骨架由肌动蛋白微丝、中间丝和微管组成,对维持细胞形状和细胞黏附等大多数细胞功能至关重要。β-tubulin是微管的主要成分之一
[31]。微管是细胞骨架聚合物,对许多重要的细胞功能(如维持细胞形状、分裂、迁移和囊泡运输)尤为重要
[32]。Paxillin是一种重要的黏附相关蛋白,由于其在细胞黏附过程中被FAK磷酸化,因此是FAK的靶标
[33]。Lu等
[34]研究发现,Paxillin参与Talin对整合素的激活,并引了快速配体后细胞黏附事件,如局灶黏附组装、信号传导、细胞扩散和迁移。Krt对于细胞的机械缓冲、细胞器定位、细胞凋亡、迁移、黏附以及与其他细胞骨架成分的相互作用至关重要
[35]。纤毛的协调摆动伴随着平滑肌收缩,也在人类生殖过程中发挥作用,引导卵母细胞通过输卵管进入子宫
[36]。纤毛摆动是由运动蛋白的协调活动所驱动的。
DNAH5是原发性纤毛运动障碍中突变最多的基因,可导致纤毛超微结构和功能异常
[37]。RSPH9对维持纤毛和鞭毛的正常运动具有重要作用
[38]。FOXJ1是纤毛发生的主调节因子,可改变其他纤毛相关基因的表达,影响纤毛的组装和周转
[39]。由于F-actin重新排列与细胞周期和细胞迁移密切相关,故F-actin在许多细胞过程中发挥着重要作用。研究表明,肌动蛋白动力学缺陷是纤毛发生缺陷的根本原因
[40]。
4 结论
HXG可抑制ov-Talin1输卵管上皮细胞的黏附能力,降低纤毛运动相关蛋白和细胞骨架蛋白的表达,从而治疗TEP。其潜在机制可能与抑制Rap1/Talin1/integrinβ3信号通路有关。
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