脓毒症是由于宿主对感染的反应失调而导致的危及生命的器官功能障碍,是一个重要的全球性健康问题,全球每年有近4 900万新发病例和1 100万例死亡
[1]。脓毒症最常见的原因是肺炎
[2],目前肺源性脓毒症已成为ICU占比最高(64%)的脓毒症类型
[3]。因此发现新的治疗靶点防治脓毒症至关重要。
蛋白质可以说是疾病和健康的所有生命过程中的最终参与者
[4]。人血浆蛋白质组由分泌或流入循环系统的蛋白质组成,在循环系统中执行调控信号传导、免疫功能、修复组织、运输物质等功能
[5]。血浆蛋白质组学可以在一定程度上体现当前全身性疾病的过程和整体生理状态。而且血浆蛋白质组学可以通过微创的样本采集法,并且更容易重复检测,以监测疾病进展或对治疗的反应
[6]。研究人员常通过患者样本中鉴定和定量多种蛋白质,研究脓毒症进展和治疗反应相关的动态变化
[7]。血浆蛋白也是作为药物开发的不可缺少的靶点因素。
孟德尔随机化(Mendelian randomization,MR)是一种当前已被广泛运用的流行病学研究的方法,通过孟德尔随机化从4 907种血浆蛋白中筛选出于肺源性脓毒症相关的血浆蛋白,随后利用相应蛋白进行蛋白网络互作寻找相关作用关系,并查找对应基因进行GO(gene ontology)功能及KEGG(kyoto encyclopedia of genes and genomes)富集分析找出与脓毒症密切相关潜在机制,最后通过筛选出的网络核心基因进行药物富集分析,并对相应药物进行分子对接。
1 资料与方法
1.1 研究设计
以全基因组关联研究(genome-wide association study, GWAS)数据为统计数据,把肺源性脓毒症的数据设置为结局变量,4 907种血浆蛋白设置为暴露因素,在此次数据统计过程中将单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)设置为工具变量,满足如下3个假说:①血浆蛋白作为暴露因素与工具变量紧密关联;②工具变量与其余混杂因素无关;③工具变量只能通过暴露因素(血浆蛋白)作用与结局因素(肺源性脓毒症)相关。
1.2 数据来源
肺源性脓毒症数据来源于
https://gwas.mrcieu.ac.uk/,ID为finn-b-SEPTICHE_PNEUMONIA,人口类型为欧洲,研究对象为208 794个体,其中包括470例患者和208 324名对照者。血浆蛋白质组学数据来源于Ferkingstad等
[8]进行的研究,该研究使用4 907个适体在35 559名冰岛人队列中测量的血浆蛋白质水平的GWAS。
1.3 工具变量选择
基于工具变量的3个假说,将P阈值设置为P<1×10-8筛选出与血浆蛋白密切相关的显著基因遗传位点,将反映两个位点之间关联程度的r2作为连锁不平衡参数设置为<0.001,为确保工具变量的独立性,将遗传距离设为10 000 kb。为了去除弱工具变量造成的偏倚,通过F=R2(N-2)/(1-R2)计算F值,若F<10则去除,并同时去除相关混杂因素,若F>10,则保留其结果。其中F表示工具变量强度统计量;R2表示遗传工具变量(IV)对暴露(血浆蛋白)的表型方差解释度;N表示用于发现暴露(血浆蛋白)与基因位点关联的GWAS样本量。
1.4 孟德尔随机化分析
所有数据统计分析均使用R 4.4.0软件,采用“TwoSampleMR”程序包和 “ieugwasr”包进行数据分析及绘图,运用Egger回归法、加权中位数法(weighted median)、逆方差加权法(inverse variance weighting,IVW)、简单模式法(simple mode)、加权模式法(weighted mode)等5种方法并通过P判断暴露因素和结局变量之间因果关系的密切程度,通过OR(odds ratio)值评估二者之间的作用关系。本文研究以IVW方法为标准,配合其余4种方法的OR值作为参考。
运用MR-PRESSO(Mendelian randomization pleiotropy residual sum and outlier)法、 MR-Egger截距测试评估结果中多效性
[9]。将Cochran’s Q法作为检测工具变量的异质性,如果
P>0.05则认为遗传工具变量没有异质性,运用留一法筛选稳定的结果。最后筛选出符合下列要求的结果:①IVW方法结果
P<0.05;②5种孟德尔方法的OR值具有一致性,如都>1或都<1;③多效性结果
P>0.05。并绘制孟德尔随机化森林图、圈图,根据得出显著靶点的基因再绘制曼哈顿图。
1.5 GO功能、KEGG富集分析
把孟德尔随机化分析结果得出的具有显著关联的血浆蛋白,提取并转换为基因ID,若转换基因ID为空则去除该项,再利用“clusterProfiler”等进行GO功能及KEGG富集分析,并对结果进行可视化,生成气泡图、柱状图。
1.6 核心网络靶点图绘制
把孟德尔随机化分析结果得出的具有显著关联的血浆蛋白上传至String数据库(
https://cn.string-db.org/),物种选择homo sapiens(智人),置信度设置为0.15,并删除部分游离节点,得到潜在的作用靶点的蛋白互作网络。随后将String结果导入cytoscape3.7.2,利用cytoHubba插件并对其进行分析得出节点,排前10的基因认为是核心基因,并根据节点多少运用不同颜色表示而制作网络图。
1.7 分子对接
通过DsigDB(
https://dsigdb.tanlab.org/DSigDBv1.0/)下载药物与基因相关的数据,将前面分析得出的核心基因通过R软件与数据库中基因药物关系进行匹配,得到药物富集结果,并进行可视化。
通过得到的药物富集结果,找出节点最多的药物及对其相关的基因与蛋白。通过pubchem(
https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)得到药物的3D结构,通过rcsb(
https://www.rcsb.org/)找到核心靶点蛋白的结构。通过网站(
https://cadd.labshare.cn/cb-dock2/index.php)进行分子对接,选择自由能分数最低的结果进行可视化,分子对接通过选择cartoon、二维结构等样式进行可视化优化,最后得出分子对接结果。
2 结果
2.1 孟德尔随机化分析结果
经过孟德尔随机化分析,并对结果进行筛选后得出44种血浆蛋白与肺源性脓毒症关系密切,其中包括29种促进肺源性脓毒症风险的血浆蛋白,15种具有降低肺源性脓毒症风险的血浆蛋白,如
图1~
图3所示。
2.2 GO功能、KEGG富集分析结果
GO富集分析结果提示,生物过程有182个,相关细胞组分128个,相关分子功能39个。生物过程里联系显著、节点较多。包括:急性炎症反应(acute inflammatory response)、止血的负向调控(negative regulation of hemostasis)、血液凝固的负向调控(negative regulation of blood coagulation);主要细胞组分有:细胞质囊泡腔(cytoplasmic vesicle lumen)、分泌颗粒腔(secretory granule lumen)、囊泡腔(vesicle lumen);主要分子功能有:生长因子结合(growth factor binding)、钙依赖性蛋白质结合(calcium-dependent protein binding)、丝氨酸型肽酶活性(serine-type peptidase activity)。KEGG信号通路富集结果提示具有密切关系的通路包括:补体系统(complement and coagulation cascades)、哮喘(asthma)、PI3K-Akt信号通路等,如
图4和
图5所示。
2.3 核心网络靶点图绘制
经过筛选得出前十的靶点主要包括
LCN2、
CHGA、
FBLN1等,如
图6所示。
2.4 分子对接
通过核心基因与数据库中药物进行匹配筛选,得出6个药物与相关靶点具有联系,其中靶点较多,关系较为密切的药物为醋酸甲羟孕酮(Medroxyprogesterone acetate)、5-氮杂胞嘧啶水合物(5-azacytidine)、米非司酮(mifepristone)等。靶点与药物联系图如
图7所示。再对醋酸甲羟孕酮于相关的IGFBP5、LYVE1、LCN2进行分子对接,结果如
图8~
图10所示。
3 讨论
通过双样本孟德尔随机化分析,对4 907种血浆蛋白与肺源性脓毒症进行分析,得出44种蛋白与肺源性脓毒症密切相关。并利用相关蛋白进行核心靶点分析、GO与KEGG富集分析得出相关蛋白与肺源性脓毒症之间的潜在作用机制。最后通过核心靶点,查找可能作用改靶点的药物,并进行分子对接。
LCN2属于脂钙蛋白超家族的一员,LCN2是一种由大约178个氨基酸组成的蛋白质,具有一个脂质结合口袋结构,用于结合和运输小分子,已被确认是抗微生物过程、氧化应激和炎症中的关键因素
[10]。LCN2是炎症反应中重要的调节蛋白,在炎症状态下其表达水平显著增加,通过多种途径参与炎症的调节,LCN2的表达增加有利于炎症的发生。在脓毒症中,全身性感染引发强烈的炎症反应,免疫系统失调也是导致全身炎症反应和多器官功能障碍的关键因素,LCN2可能通过调节炎症过程和影响免疫细胞的活性参与脓毒症的发病机制
[11]。LCN2还是肾损伤的生物标志物,在酒精性脂肪性肝炎患者的中性粒细胞中增加,高血浆LCN2还预测严重脓毒症和脓毒性休克患者的高死亡率和心功能障碍,且在脓毒症心肌病小鼠中敲低LCN2可以抑制铁超载减轻细胞程序性死亡减少脂质过氧化从而达到保护器官功能损伤的作用,故LCN2可能是治疗脓毒性心肌病的一种有希望的方法
[12]。
LYVE1是淋巴管内皮的主要透明质酸受体,它能够结合透明质酸,帮助透明质酸通过淋巴系统运输,这对于维持组织液平衡、免疫监视和炎症反应至关重要,LYVE1的表达常常与淋巴系统有关,能抑制癌细胞的增殖、迁移和淋巴结转移
[13]。LYVE-1已被鉴定为肝窦内皮细胞的标志物,小鼠LYVE-1缺失导致全身淋巴结中淋巴管、小肠绒毛和淋巴管的急性丧失,会使内皮表面细胞黏附分子的免疫反应性降低,减少白细胞浸润至感染部位,从而减轻脓毒症组织损伤。文献[
14]认为LYVE-1在淋巴血管系统的维护中起着重要作用。与之相反的研究却认为,LYVE1作为主要淋巴标志物之一,主要在淋巴管内皮表达,而高LYVE-1淋巴管密度与远处转移和不良结局的风险增加相关
[15]。与脓毒症相关研究较少,可能与LYVE-1在免疫和炎症及维护淋巴系统相关。
IGFBP5能够调节细胞的生长、分化以及凋亡,主要通过调节胰岛素样生长因子(insulin-like growth factor,IGF)的生物活性和稳定性发挥功能
[16]。虽然在IGFBP家族中IGFBP5的研究相对较少,但也被证实已在包括卵巢癌
[17]、乳腺癌
[18]和胶质母细胞瘤
[19]在内的几种癌症中充当肿瘤抑制因素,具有保护作用。据文献[
20]报道,IGFBP5在肿瘤患者中的表达水平与年龄成正比,且与预后及生存率相关性大,其机制可能与血管生成、上皮-间质转化及影响癌细胞生长和迁移功能有关,且IGFBP5突变频率较高,可在对应密码子热点的可变结构域中插入或缺失,从而增加突变率。IGFBP5的表达还在骨骼、卵巢、乳腺、肾脏和肝脏中发挥重要作用
[21]。虽然IGFBP5与脓毒症的研究也较为少见,但危重病可诱导(生长激素/胰岛素样生长因子结合蛋白)轴的多方面改变,伴随着IGF-1水平的改变,IGFBP家族中IGFBP-1已经成为急性危重病中IGF活性的重要调节剂,相反IGFBP5在危重病的慢性期下降
[22],且根据孟德尔分析及生物信息分析,IGFBP5可能与脓毒症关系密切,有待进一步研究,可能具有作为预后标志物的潜在效用。
醋酸甲羟孕酮,是一种人工合成的孕激素药物。它常用于多种妇科相关疾病的治疗,包括内分泌替代治疗、避孕,以及子宫内膜异位症等
[23]。此外还被用于治疗某些因激素依赖性而生长的癌症,如乳腺癌。它通过模拟自然孕酮的作用来调节女性激素,从而达到治疗目的
[24]。孕激素在临床治疗运用广泛,Qiang等
[25]通过给孕激素,显著提高了败血症雄性(从30%提高到70%,样本数
n=20,
P=0.041)和雌性(从50%提高到80%,
n=30,
P=0.026)小鼠的生存率。文献[
26-
27]认为孕激素可以选择性地降低组织蛋白质酶原L触发的几种趋化因子的产生。例如,上皮性中性粒细胞激活肽(epithelial neutrophil-activating peptide 78,ENA-78)、单核细胞趋化蛋白-1(monocyte chemoattractant protein-1,MCP-1)或(MCP-3)和细胞因子(如TNF、IL-6或IL-10)。高迁移率组蛋白B1(high-mobility group box 1,HMGB1)参与了脓毒症,通过核受体相互作用蛋白1可以通过激活HMGB1表达释放IL-6、IL-1、TNF-α等炎症因子促进脓毒症进一步加剧,而孕激素可以抑制HMGB1释放IL-6,作者认为这可能为孕激素在脓毒症中起到保护作用提供理论支持。
根据孟德尔随机化和生物信息学分析对脓毒症与血浆蛋白及相关基因进行了多重分析,并对相关性密切、节点较多的蛋白基因进行分析,找出相应的药物并进行分子对接。从而对脓毒症的防治提供一定支持。
4 结论
综上,通过运用孟德尔随机化分析评估血浆蛋白与肺源性脓毒症之间的因果关系,及生物信息学技术与分子对接技术进行进一步靶点预测与寻找相关潜在药物,构建了“血浆蛋白-核心靶点-潜在药物”研究框架为肺源性脓毒症的精准诊疗提供了新思路,揭示了血浆蛋白在肺源性脓毒症发病机制中的重要作用,得到以下结论。
(1)双样本孟德尔随机化分析有效揭示了血浆蛋白与肺源性脓毒症之间的潜在因果关系,同时通过GO与KEGG分析揭示了补体与凝血级联反应、PI3K-Akt信号通路、以及免疫与炎症相关通路可能是血浆蛋白介导肺源性脓毒症发病的核心途径。
(2)关键蛋白(如LCN2、LYVE1和IGFBP5)可能作为肺源性脓毒症的新型生物标志物与潜在治疗靶点。
(3)药物靶点预测与分子对接支持了部分现有药物(如醋酸甲羟孕酮)可能通过抑制炎症因子(如HMGB1、IL-6等)在肺源性脓毒症治疗中发挥保护作用,为药物再利用提供了理论依据。
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