缺血性脑卒中(ischemic stroke, IS)又名脑梗死,是脑组织因缺血而发生坏死的临床综合征。临床上,在对患者进行积极干预使脑组织迅速恢复血流后,却出现神经系统损伤加重的现象,此现象被称为脑缺血再灌注损伤(cerebral ischemia reperfusion injury,CIRI)
[1-2]。其临床上主要表现神经功能障碍
[3],卒中已成为全球第二大死亡原因,其中缺血性卒中患者约占卒中患者80%。目前缺血性卒中的临床治疗包括再灌注治疗和神经保护治疗
[3],本病急性期内科治疗包括溶栓治疗和抗栓治疗
[4],除了传统的常规疗法,采用干细胞[人羊膜上皮干细胞、多能干细胞、CD34阳性造血干/祖细胞(CD34-positive hematopoietic stem and progenitor cells, CD34+ HSPCs)、多系分化应激耐受细胞(multilineage-differentiating stress-enduring cells,muse cells)、内皮细胞、细胞外小泡]进行治疗也可改善中风预后及促进神经退行性变
[5]。此外,中药治疗本病也越来越受到研究者的关注。
淫羊藿(
Epimedium)又称弃仗草,可应对衰老相关问题,还可用于治疗筋骨病、风湿性疾病、心血管等疾病
[6]。其中淫羊藿苷(Icariin)是其主要成分之一,其是脑缺血再灌注动物模型的神经保护剂,其药理作用
[6]不仅包括改善性功能障碍、促进雌激素合成、治疗骨质疏松症,还包括免疫调节、抗炎作用、抗氧化活性、抗衰老、抗菌、抗肿瘤及改善心血管功能。Wu等
[7]发现淫羊藿苷治疗可以减轻脑缺血再灌注小鼠海马和皮层的病理生理变化,其可缓解促凋亡和抗凋亡蛋白的失衡。Dai等
[8]表明淫羊藿苷可上调肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor alpha,TNF-α)、白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、B细胞淋巴瘤2蛋白相关X蛋白(Bcl-2-associated X protein,Bax)、天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3(cysteine aspartate protease-3,Caspase-3)的表达、下调B细胞淋巴瘤2蛋白(B-cell lymphoma 2,Bcl-2)表达,并还能抑制核因子κB(nuclear factor kappa B,NF-κB)的激活,其可促进脑缺血再灌注大鼠核因子E2相关因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2,NRF2)和过氧化物酶体增殖物激活受体(peroxisome proliferator-activated receptors,PPARs)表达的激活,从而达到对细胞凋亡和炎症的抑制作用。
文献[
9]发现淫羊藿苷可能抑制NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NOD-like receptor pyrin domain cont aining 3,NLRP3)信号通路及凋亡相关斑点状蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing a C-terminal caspase recruitment domain,ASC)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1(cysteine aspartate protease-1,caspase-1)、白细胞介素-18(interleukin-18,IL-18)、白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)的表达,从而发挥脑保护作用,但其作用机制是否与调控NLRP3信号通路上游靶点沉默信息调节因子1(silent information regulator factor 2-related enzyme 1,SIRT1)有关,目前尚不清楚。因此,现通过分子对接及实验探究淫羊藿苷对缺血性脑卒中的机制,从而明确其抗缺血性脑卒中的潜在作用机制,以期为临床抗缺血性脑卒中的研究提供更丰富的科学依据。
1 材料
1.1 动物
SPF级健康成年SD 雄性大鼠140只,体重250~280 g,购于湖南斯莱克景达实验动物有限公司,许可证编号: SCXK(湘)2019-0004。
1.2 伦理审查
本实验由贵州中医药大学动物实验中心伦理委员会批准,伦理审核批件编号:20230091,所有实验操作均严格按照贵州中医药大学实验动物伦理委员会规定的动物伦理福利条款执行。
1.3 药物
淫羊藿苷购自西安米先尔生物科技有限公司,批号:MXE20230725。SIRT1特异性抑制剂EX527,由碧云天有限责任公司提供,批号:SC0281。
1.4 主要试剂及仪器
Solarbio 2%TTC染色液、HE染色试剂盒、IL-6试剂盒、 IL-1β试剂盒(江苏酶免有限公司,批号:G3005、G1076、MM-0190R1、MM-0047R1);兔源I抗SIRT1抗体(Servicebio,批号:GB11512-100);二甲苯(国药集团,批号:10023418);二甲基亚砜(Servicebio,批号:GC203002);组织自发荧光淬灭剂(Servicebio,批号:G1221);抗荧光淬灭封片剂(Servicebio,批号:G1401) 。
A2-263650大鼠MCAO栓线(北京西浓科技有限公司); KD-P组织摊片机(浙江省金华市科迪仪器设备有限公司); E100显微镜(Nikang仪器有限公司); D3024R台式高速冷冻离心机(大龙); Epoch酶标检测仪(BioTeK)。
2 方法
2.1 淫羊藿苷药动学评估
运用中药系统药理学数据库来检索淫羊藿苷药动学相关参数, 即口服生物利用度(oral bioavailability,OB)、 类药性(drug-likeness,DL) 等。
2.2 分子对接
从 RCSB (research collaboratory for structural bioinformatics,RCSB )蛋白质晶体结构数据库(
http://www. rcsb. org/pdb )获取IL-6(1ALU) 和 SIRT1 (PDB ID: 1YVL)。利用SYBYL分子设计系统(software your business link,SYBYL)2.1.1对蛋白晶体结构进行抽离配体、删除水分子、加氢、修复侧链氨基酸、加电荷、提取配体等前处理,保存备用,其他参数均设为默认值。
2.3 造模
除假手术组外,其余动物参照吴琳等
[10]的方法建立大鼠一侧缺血性脑卒中模型, 术前禁食不禁水,打开空调,保持温度适宜,10%水合氯醛(0.3 mL/100 g )腹腔注射后,待大鼠麻醉充分完全,将其固定于事前已消毒的鼠用手术板上。用小刀刀片备皮,备皮围绕手术切口周围,将刮落的鼠毛清理干净,再用碘伏消毒,消毒范围略大于备皮范围,以颈部前正中线为切口,钝性分离肌肉和筋膜,用镊子缓慢地拨开皮下组织,取两根棉签轻柔交替进行血管搓粗,找到颈总动脉,用玻璃分针轻柔剥离出颈总动脉周围的迷走神经,并顺着颈总动脉往上方依次找到颈外动脉和颈内动脉,将靠近颈总动脉分叉的颈外动脉及颈内动脉上包裹的组织小心分离。在靠近分叉的颈外动脉下穿一条3-0丝线,并进行结扎,结扎的位置距离颈总动脉分叉处0.6~0.7 cm,在靠近近心端的颈总动脉下穿一条3-0丝线,再进行结扎,结扎的位置尽量靠近近心端,再将动脉夹夹住颈内动脉,所夹的位置距离颈总动脉分叉0.3~0.4 cm。在颈总动脉上置入一活结,活结的位置距离颈总动脉分叉0.2 cm。用眼科剪在靠近活结约0.1 cm处剪一小口,用镊子夹持带有标记的线栓呈40°左右角度从小口倾斜进线,再改变进线角度缓慢进线。当进线到颈内动脉时,将颈总动脉活结扎紧,注意活结不能系得太紧或太松。去除动脉夹,当线栓的标记点进入到分叉口处时则停止进线,插入深度为(18.5±0.5) mm,并记录插入时间。将颈总动脉活结结扎,结扎后剪除多余的线,消毒缝合切口,并在切口处使用青霉素软膏避免感染。2 h后拔出线栓实施再灌注。并于动物麻醉苏醒后实施神经功能评分,参照文献中评分方法
[11],0分:无神经功能缺损症状;1分:前爪不能完全伸展而弯曲;2分:向瘫痪侧追逐尾巴绕圆圈;3分:一侧瘫痪导致行走艰难;4分:无活动状态。其中1~3分提示造模成功,0分或者4分提示造模失败。
2.4 分组及给药
将造模成功的大鼠随机分为模型组、淫羊藿苷高剂量组(80 mg/kg)、中剂量组(40 mg/kg)、低剂量组(20 mg/kg)、淫羊藿苷高剂量+SIRT1特异性抑制剂赛利司他(6-Chloro-2,3,4,9-tetrahydro-1H-carbazole-1-carboxamide,EX527)组、EX527组,每组20只,将20、40、80 mg淫羊藿苷加入10 mL的双蒸水中配成2、4、8 g/L,分别为淫羊藿苷低、中、高剂量药物,每只鼠灌胃给药10 mL/kg,EX527组给药剂量和方式参考谭惠中等
[12]的实验方法, EX-527 溶于5%二甲基亚砜中,浓度为1 mg/mL,剂量为5 mL/kg,EX527组于造模前每两天腹腔注射给药一次,一共4次;假手术组用等体积的生理盐水灌胃给药;淫羊藿苷各组分别于缺血24、48、72 h给药1次
[13]。
2.5 样本采集
所有组于末次给药(造模72 h)后取材,并在取材前再次进行神经功能评分。取材前1日准备好取材所需器材。于取材前每组选6只大鼠,禁食12 h但不禁水,称重后用10%水合氯醛麻醉大鼠(按照3 mL/kg的比例腹腔注射),并佩戴好口罩及护目镜。待掐大鼠尾尖其反应消失,此时表示大鼠麻醉完全。将大鼠仰卧固定在已消毒手术板上,备皮消毒,用眼科剪沿着腹部前正中线打开腹腔,用棉签将肠管拨到一边,再用棉签柔和分离脊柱前的脂肪及筋膜,找到腹主动脉。在靠近腹主动脉近心端用止血动脉夹,夹闭腹主动脉,用一次性采血针针尖朝上与腹主动脉成1°左右角度刺进血管,深度大约5 mm,去除动脉夹回抽采血。当腹主动脉肉眼见到瘪陷时停止回抽,不可有太大回抽压力,当动脉重新充盈后继续回抽,每只鼠取1或2管,管壁贴上标签标记好动物的分组号码。采血结束后处死动物,立即将处死的大鼠的头背部固定好,碘伏消毒后用眼科剪剪开头背部正中线皮肤,轻轻剪开后部正中头骨,用止血钳向两侧轻轻剥开暴露大脑,取出完整大脑。一部分放入-20 ℃冰箱用于氯化三苯基四氮唑 (triphenyltetrazolium chloride,TTC),一部分放入4%多聚甲醛固定用于苏木精-伊红染色(hematoxylin-eosin staining,HE)及免疫荧光染色。取血后静置几分钟,待血液凝固后,取液体部分进行离心分离,用离心机取上清液(10 ℃以下,以4 000 r/min离心10 min),分装上清置于-20 ℃以下冰箱保存,并防止反复冻融
[14]。
2.6 指标检测
(1)TTC染色检测脑组织梗死体积:神经功能评分结束后,每组选4只大鼠麻醉,获得完整脑组织,参照文献[
15]的方法进行TTC染色,运用ImageJ系统分析各组大鼠脑梗死率(脑梗死率=脑梗死区体积/全脑体积×100%)。
(2)HE染色检测脑组织皮层病理情况:按试剂盒说明书分别操作,并参照文献[
16]方法检测缺血侧脑组织皮层病理情况。
(3)酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测血清中 IL-1β、IL-6的含量按试剂盒说明书分别操作,并参照文献[
17]具体操作方法检测大鼠血清中IL-1β、IL-6的含量。
(4)免疫荧光染色检测皮质区SIRT1荧光表达情况:参照文献[
18]详细操作方法检测缺血侧脑组织皮层SIRT1荧光表达水平。
2.7 统计学处理
采用SPSS 26.0统计软件对数据进行处理,结果用平均值±标准差(
$\overline{x}$±
s)表示,组间比较时根据方差齐性与否分别采用不同统计学方法,具体方法参照文献[
19],组间比较采用单因素方差分析,方差齐性用Dunnett
t检验对各组与空白组相比,或采用LSD法进行两两比较,方差不齐的数据用 Dunttett T3检验方法。
P<0.05为差异有统计学意义。
3 结果
3.1 淫羊藿苷的药动学特性
淫羊藿苷的OB为41.58%,DL为0.61,符合中药系统药理学数据库建议的药物筛选标准
[20](OB≥30% 且DL≥0.18),表明淫羊藿苷具有候选药物的分子特征。基于SYBYL2.1.1对淫羊藿苷化学成分进行优化,优化结构如
图1所示。
3.2 分子对接结果
淫羊藿苷与IL-6和SIRT1可以稳定结合(总评分(total score,TS)>4), 淫羊藿苷与IL-6形成3个氢键, 淫羊藿苷与SIRT1形成2个氢键, 淫羊藿苷分别与IL-6和SIRT1形成多个疏水作用。淫羊藿苷与IL-6和SIRT1的结合口袋图如
图2、
图3所示。
3.3 淫羊藿苷对大鼠神经功能缺损评分影响
如
表1所示,在灌胃淫羊藿苷之前,与假手术组对比,另外5组分值与其保持一致;而灌胃淫羊藿苷后,与第一次神经功能缺损评分对比,所有组分值都呈下降趋势。与模型组对比,除了EX527组神经功能评分略升高,其他各组分值都降低(
P<0.05),而与淫羊藿苷高剂量对比,淫羊藿苷高剂量+EX527组神经功能状态评估更差(
P<0.05)。与EX527组比较,淫羊藿苷高剂量+EX527组神经功能状态评估更良好(
P<0.05)。表明淫羊藿苷具有改善脑缺血再灌注大鼠神经功能障碍的作用,而EX527不具有改善神经功能障碍作用。
3.4 淫羊藿苷对大鼠脑梗死体积影响
对7组大鼠脑梗死体积进行探索,结果如
图4所示。与假手术组比较,模型组脑梗死程度严重(
P<0.01)。与模型组比较,淫羊藿苷高、中、低剂量组脑梗死程度有所减轻(
P<0.01),EX527组脑梗死程度与之变化不明显。与淫羊藿苷高剂量组相比,淫羊藿苷高剂量+EX527组脑梗死程度稍严重(
P<0.05)。与EX527组比较,淫羊藿苷高剂量+EX527组脑梗死程度有所改善(
P<0.05)。由此说明了淫羊藿苷可以改善脑梗死体积,而EX527不具有改善脑梗死体积作用。
3.5 淫羊藿苷对大鼠脑组织病理影响
如
图5、
图6所示,假手术组大脑皮层细胞数量丰富,未见坏死及炎性细胞浸润。与假手术组比较,模型组大脑皮层可见大范围梗死,且皮层断裂、排列紊乱、胞核固缩或碎裂、胞质崩解,神经细胞数量明显减少。与模型组比较,淫羊藿苷高、中、低剂量组大脑皮层梗死范围缩小、神经细胞数量增多; 而EX527组脑组织皮层梗死范围扩大、神经细胞数量减少。与淫羊藿苷高剂量组相比,淫羊藿苷高剂量+EX527组梗死范围扩大,神经细胞数量减少;与EX527组比较,淫羊藿苷高剂量+ EX527组梗死范围缩小,神经细胞数量略增多。
3.6 淫羊藿苷对大鼠血清白介素水平影响
对各组大鼠白介素水平分析,如
表2所示,其差异具有统计学价值,相比于假手术组,模型组IL-6、 IL-1β水平上调(
P<0.01);相比于模型组,EX527组IL-6、 IL-1β水平上调(
P<0.01),淫羊藿苷低剂量组、中剂量组、高剂量组及高剂量+EX527 组IL-6、 IL-1β水平下调(
P<0.05),尤以淫羊藿苷高剂量组下调明显。相比于淫羊藿苷高剂量组,淫羊藿苷高剂量+EX527组IL-6水平略升高,IL-1β水平略降低。相比于EX527组,淫羊藿苷高剂量+ EX527组IL-6、 IL-1β水平降低(
P<0.05)。由此验证淫羊藿苷可通过抑制大鼠体内炎症因子IL-6、IL-1β的表达对大脑起到保护作用,SIRT1抑制剂EX527对大鼠IL-6、 IL-1β水平有升高作用。
3.7 淫羊藿苷对大鼠皮质区SIRT1荧光表达情况影响
对大鼠脑组织皮层SIRT1荧光检测,结果如
表3、
图7、
图8所示,蓝色荧光标记细胞核,红色荧光标记SIRT1,假手术组SIRT1光密度值是0.43,与假手术比较,模型组大脑皮层SIRT1光密度值表达降低为0.20。与模型组相比,淫羊藿苷高、低剂量组大脑皮层SIRT1光密度值升高,EX527组明显降低。另对各组图片进行辨析,与假手术组辨析得出:模型组SIRT1表达下调(
P<0.01);与模型组辨析得出:淫羊藿苷高、中、低剂量组红色荧光增量,即暗示这三组SIRT1表达上调(
P<0.05),而EX527组红色荧光减量暗示SIRT1表达下调(
P<0.05)。与淫羊藿苷高剂量组辨析得出:淫羊藿苷高剂量+EX527组SIRT1表达下调(
P<0.05)。与EX527组辨析得出:淫羊藿苷高剂量+ EX527组SIRT1表达上调(
P<0.05)。说明淫羊藿苷对脑缺血再灌注大鼠大脑皮层SIRT1有升高作用, 而EX527能降低SIRT1荧光表达。
4 讨论
缺血性卒中属于中医“中风”范畴,因其表现犹如中了“邪风”一样既突然又善变,中医认为本病发病机制
[21]与内风、五志、痰浊、瘀血、肝肾有关,发病机制最主要学说为“气虚血瘀学说”,该学说认为行气活血是治疗方法,益气活血是治疗中风的基本原则,本病总治法以活血化瘀为主。
当血栓或动脉粥样硬化导致血管堵塞时,就会导致大脑的血液供应中断。西医认为本病的病因
[22]与心血管疾病、内分泌疾病、脑动脉炎、吸烟及酒精中毒、遗传、外伤等有关。本病病理生理
[23] 主要包括血栓形成及溶解的病理生理、再灌注病理生理,抗凝活性减低与血栓形成密切联系;能量代谢障碍、活性氧过量产生、一氧化氮失调为再灌注形成病理生理,本病病理生理学主要表现为炎症反应,即主要表现为小胶质细胞活化。
缺血性脑卒中导致神经细胞死亡主要原因为炎症反应,其和本病的高死亡率及致残率紧密联系。卒中后的炎症反应主要为小胶质细胞释放一氧化氮溶酶体酶、活性氧自由基、IL-1β、IL-6、TNF-α等,其会聚集丰富的炎性细胞,并导致炎性因子分泌过多,这些炎性因子可使脑损伤愈发加重
[24]。IL-6是中枢神经系统炎症的有效介质,星形胶质细胞来源的IL-6可导致神经炎症,而IL-6促进小胶质细胞过度活化,增加IL-1β的释放,最终加重神经炎症。IL-6为调节炎症的重要炎症因子,其能推动小胶质细胞过度活化,进一步使IL-1β分泌增多,IL-1β参与神经细胞和内皮细胞炎性小体成分合成和组装,其导致IL-1β原的裂解和IL-1β的成熟,IL-1β 是导致随后炎症加重的原因
[25]。目前研究淫羊藿苷抑制神经炎症的机制仍不明晰,有两种假说:一种假说认为淫羊藿苷可能通过上调过氧化物酶体增殖物激活受体α (peroxisome proliferator-activated receptor alpha,PPARα)、过氧化物酶体增殖物激活受体γ (peroxisome proliferator-activated receptor gamma,PPARγ)表达抑制神经炎症,从而保护脑神经细胞,另一种假说认为淫羊藿苷抑制转化生长因子β1(transforming growth factor beta 1,TGF-β1)信号从而达到对脑缺血神经保护作用
[25]。本文实验结果显示,经淫羊藿苷干预后,血清中两种炎症相关指标(IL-1β、IL-6)含量下降,说明淫羊藿苷通过减轻炎症反应起到治疗效果。另外成功的造模对于本病研究有重要意义,根据神经功能缺损评分,本文研究的造模是成功的,经淫羊藿苷干预后,本病导致的神经功能缺损明显改善。
而参与各种生物过程(包括炎症)的SIRT1是一种烟酰胺腺嘌呤二核苷酸依赖性脱乙酰酶,其主导炎症反应,并可去乙酰化和灭活NF-κB的p65亚基负向调节IL-6、IL-1β,其可通过激活自噬、抑制炎症通路来保护脑组织。脑缺血再灌注损伤在缺血区诱导纤维化瘢痕形成
[26],并伴有SIRT1表达下调,SIRT1可减少纤维化瘢痕,当SIRT1上调时可减少梗死体积、改善尼氏体结构,SIRT1能上调生长相关蛋白43(growth associated protein 43,GAP-43)和突触素(Synaptophysin,SYP)的表达,并且能抑制成纤维细胞增殖,从而达到保护神经细胞作用,Li 等
[27]研究认为SIRT1可抑制氧化应激和炎症反应,从而减少缺血性中风的脑损伤。上述研究均表明SIRT1介导本病且发挥了重要作用。因此本研究从SIRT1通路探讨了淫羊藿苷在本病中的抗炎作用机制,结果表明,与假手术组对比,模型组存在很严重炎症反应,且脑梗死程度和范围远远超过假手术组,其大脑皮层SIRT1蛋白表达明显下降,当给予淫羊藿苷干预后,脑梗死程度和范围改善,并且升高了大脑皮层SIRT1蛋白表达,这表明淫羊藿苷能够激活SIRT1信号通路、抑制炎症反应,从而发挥脑保护作用,这和Ning等
[28]等一致。Ning等
[28]报道淫羊藿苷可调节SIRT1的表达,其可抑制β淀粉样蛋白合成并改善与阿尔茨海默病相关的其他β淀粉样蛋白的级联发病症状。
本文研究结果进一步暗示了SIRT1与IL-6及IL-1β呈现负相关,这与龙思凡
[29]、Chen 等
[30]研究结果是相同的。龙思凡
[29] 表明SIRT1 高表达会抑制IL-1β水平,SIRT1低表达会使IL-1β释放增加,进而导致中枢神经细胞受损,促发阿尔茨海默病病变。Chen 等
[30]研究发现SIRT1正向调节核因子E2相关因子2(Nuclear factor erythroid 2-related factor 2,NRF2)抗氧化信号,负向调节核转录因子kappa B 的p65亚基(Nuclear Factor kappa B Subunit p65,NF-κBp65)的转录活性及其下游炎症级联反应,SIRT1可抑制Toll样受体4(Toll-like receptor 4,TLR4)、NF-κB表达
[31] 。
另外,本文研究结果还表明EX527干预可以阻止SIRT1的脑保护作用,这与Sarmah等
[32]研究结论不谋而合,Sarmah 等
[32]认为缺血性脑卒中大鼠SIRT1表达会减少,再给予同种异体骨髓间充质干细胞干预会增加SIRT1表达水平,而当给予EX527后,EX527会抑制同种异体骨髓间充质干细胞治疗后观察到的SIRT1水平,并且该实验还发现同种异体骨髓间充质干细胞治疗后NLRP3炎症小体及其组分IL-1β、Caspase-1、ASC水平下调。
5 结论
用SIRT1特异性抑制剂 EX527和药物一起作用于大鼠,EX527的干预能削减SIRT1水平,而淫羊藿苷可助长SIRT1升高。这些结果提示:淫羊藿苷对本病临床表现起到了改善作用,淫羊藿苷通过激活SIRT1、降低IL-6、IL-1β水平来抑制脑缺血再灌注大鼠炎症损伤,减少炎症因子的表达,抑制免疫炎症是淫羊藿苷抗缺血性脑卒中的重要途径,淫羊藿苷促使SIRT1信号传导通路的激活是其抗缺血性脑卒中的重要机制之一,SIRT1可能是淫羊藿苷发挥神经保护作用的靶点与信号通路之一。
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